Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
与他们的小而复杂的神经系统线虫已经证明了强大的工具,对于理解神经生物学的许多方面,包括行为。这类研究的大部分都集中在模式生物线虫在其中一个丰富 不同的行为已经被成功地解剖和分析。这些措施包括mechanosensory 3,4趋化,thermotactic 5,6和7磁感影响交配8,9,学习10和取食行为11。然而,其他更远亲线虫物种显示哪些没有在rhabditid C.观察到的行为线虫或交替显示的复杂性,这引起了有关其发展和监管相关问题的其他级别。这方面的一个这样的实例可以在远亲diplogastrid线虫Pristionchus pacificus,其中显示更复杂的馈送是被观察haviors和节奏比C.观察线虫1。尽管这是两个物种同源共享咽神经元12。这些额外的供给行为,巧合的P. pacificus还显示扩展的饮食范围,因为他们是狂热的食肉动物,能够通过喂养也是在其他线虫幼虫补充他们的饮食细菌的。幸运的是,P。 pacificus已发展为进行比较和综合进化生物学模型,因此许多分子和遗传工具现已上市。这些措施包括一个完全测序和基因组注释13,分子和基因工具,包括转基因14和CRISPR / Cas9 15,16以及一个详细和系统发育注释17,拥有超过25密切相关的物种,包括其新发现的物种的姐妹。此外,众多的Pristionchus物种的生态,包括P. pacificus是我们现在有被描述了许多种定义LL与共享金龟子一个necromenic协会,他们经常与其他线虫种类18共享一台主机。P.因此pacificus提供与剖析小说行为的演变及其生态意义的优秀模型系统。
为了分析在线虫物种如铜绿掠夺取食行为pacificus我们开发,便于观察和掠夺行为的量化几种新的行为检测。为P. pacificus显示二形口结构,它强烈地影响掠夺行为,正确的形态类型的识别是必不可少的1,2。窄口stenostomatous变形包含一个钝齿背在任何掠夺性喂养不参与。可替代地,广口eurystomatous变形包括大得多的爪形背齿和一个额外的相对亚腹侧齿,它们一起工作以有效地打开他们的猎物的角质层。掠夺eurystomatous到非掠夺stenostomatous形式的比率Pristionchus物种的不同而不同,也内P. pacificus然而 ,eurystomatous口的百分比变形在P. pacificus野生型菌株(PS312)通常是70 – 90%2。此外,嘴形比可能出现波动取决于不同的环境因素(包括已知的,包括饥饿和一些小分子信号以及未知因素)掠夺eurystomatous口形式,从而正确识别和隔离是成功的掠夺性检测是必不可少的。
除了掠夺口形式的描述中,我们制定了“啃法”的直接观察和掠夺性的行为,包括咬,杀害和饲养活动的定量。这里猎物线虫是通过过滤器隔离ING新饿死文化并暴露在掠夺成人P. pacificus,这是在很短的时间跨度观察在一起。此外,我们还开发了高通量“尸实验”,通过掠夺性事件的间接观测便于掠夺行为快速筛选。这需要幼虫尸体的存在优势,筛选捕食的工具。这两个实验提供了方便和高度可重复的观察和线虫如铜绿测量掠夺行为的方法pacificus。
线虫理解神经生物学和行为与C提供了一个功能强大的系统线虫迄今作为主要工具。然而,众多的线虫种类包括P. pacificus显示的行为,这是缺席或从模式生物C.复杂变化线虫 ,因此提高对这些行为的演变与调控引人入胜的问题。在许多其他线虫种类包括P.发现一个这样的附加 行为pacificus是掠夺性喂养1,20从事以补充他们的饮食细菌的能力。因此,我们已开发出并描述了详细的协议线虫这些以前未经分析的掠夺行为,容易和快速鉴定。
首先,我们提供的方法中的线虫内口馈送装置用于筛选变体。正确口型的鉴定是必不可少的头sTEP成功捕食测定法,至少在该Pristionchus只属动物eurystomatous能够掠夺性喂养。最好是,以确定口腔中的协议1.2作为此方法中描述的“快速嘴表型”协议摇身一变是侵入性的要少得多,因此,它是不太可能掠夺行为可以被扰动。但是,建议首先成为通过识别与在琼脂焊盘麻醉动物(协议1.1)熟悉不同口结构。
以下所需口变形的鉴定,我们已经描述了两种测定用于定量掠夺馈送。这些是一种快速,高通量“尸测定”(协议3)和一个更费时,但更深入的通过“咬合测定”行为分析(方案2)。这两种协议是高度灵活的,允许若干修改,以优化取决于experimen测定法TAL要求。对于使用P.咬测定在C. pacificus大鳄线虫猎物,对于10分钟的时间窗掠夺行为相互作用的观测是足以与其他馈送事件沿量化叮咬的显著量。对于“尸实验”再利用P.在C. pacificus大鳄线虫猎物,5大鳄2小时制作容易量化和一致的尸体数允许快速的行为分析。但是,应该以不同的速度指出,掠夺性线虫的举动不同的物种,吃的速度不同,一般展示其他行为1大的多样性。此外,不同的猎物物种也可以在类似的原因不同速率吃掉。因此,建议以优化基于测试既作为天敌和猎物的线虫物种的测定法,也可用于在环境条件下的任何差异。在这两次“咬”和“军团E“试验是至关重要的捕食与被捕食者是健康的,因为压力或受伤的大鳄将不能有效地杀灭。此外,新鲜的检测板是较旧的板块可以成为干出该线虫导致错误的健康造成不利影响至关重要测定,它也希望这些掠夺性试验的未来迭代将能够采取技术最新进展的优势,以自动执行大部分的分析作为已经完成调查22 C.观察到的许多行为线虫 21,目前如出现敏感得多接触它们,使得在可能废除掠夺馈送的微流体腔室的隔离和固定化的问题有可能在线虫如铜绿pacificus出现。克服此可能被证明具有挑战性的,但会促进个体线虫被筛选为微妙掠夺的行为。
最后,我们还提供了FO方法ř检查通过使用高速摄像机(协议4)定量齿和咽泵送动力学促进捕食性和细菌馈送模式之间的比较的线虫馈送装置本身。在C.咽抽水率的量化线虫已用于监测摄食多年23,但是,C。线虫没有任何形式的口锯齿和也没啥掠夺性的行为。通过结合咽与牙齿活动的泵送的量化,具体到捕食牙齿的任何神经支配也可以观察到。由于观察牙齿移动的动物经常移出焦平面所需的倍率,因此,它通常只能观察为很短的时间窗的齿。此外,不同于C.线虫 ,P的咽pacificus不连续泵,而是在抽水和饲养的法术啮合。因此,对于准确咽PUM的而喂养平速率确定,它记录15秒的连续馈送的是重要的。
这里提出这些方法,因此在线虫系统调查掠夺行为提供第一框架。此外,它们也可以是适于用在调查线虫的生态系统,包括附加生态相关生物体上捕食包括微生物,真菌和螨虫的影响范围内的其他交互。因此,他们提供了剖析这些掠夺行为是如何调节的,他们怎么可能已经进化以及它们的生态意义的手段。
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |