Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
I nematodi con le loro piccole ma complessi sistemi nervosi si sono rivelati potenti strumenti per la comprensione di molti aspetti della neurobiologia, tra cui comportamento. Gran parte di questa ricerca si è concentrata sulla organismo modello Caenorhabditis elegans in cui un gran numero di diversi comportamenti sono stati sezionati e analizzati con successo. Questi includono meccanosensoriali 3, 4 chemiotattica, thermotactic 5,6 e 7 magnetotactic influenzare l'accoppiamento 8,9, l'apprendimento e l'alimentazione 10 comportamenti 11. Tuttavia, altre specie di nematodi più distante relativi mostrano comportamenti che non si osservano nel rhabditid C. elegans o in alternativa mostrano ulteriori livelli di complessità, che solleva domande pertinenti per quanto riguarda la loro evoluzione e la regolamentazione. Uno di questi casi di questo può essere osservato nel lontanamente connessi diplogastrid nematode Pristionchus pacificus, che visualizza molto più complessa di alimentazione esserecomporta- e ritmi che si osservano in C. elegans 1. Questo nonostante le due specie condividono neuroni faringei omologhi 12. In concomitanza con questi comportamenti di alimentazione aggiuntivi, P. pacificus mostra anche una gamma alimentare espanso, in quanto sono predatori avidi, in grado di integrare la loro dieta batterica anche nutrendosi di larve di altri nematodi. Fortunatamente, P. pacificus è stato sviluppato come un modello per la biologia evolutiva e comparativa integrativo e quindi molti strumenti molecolari e genetici sono ora disponibili. Questi includono un genoma completamente sequenziato e annotato 13, strumenti molecolari e genetici, tra cui transgeni 14 e CRISPR / Cas9 15,16, nonché una dettagliata e ben annotato filogenesi 17 con oltre 25 specie strettamente correlate tra le sue specie sorelle di recente scoperta. Inoltre, l'ecologia di numerose specie Pristionchus tra cui P. pacificus è noill definito con molte specie essendo ora descritta la condivisione di una associazione Necromenic con scarabei, un host che condividono spesso con altre specie di nematodi 18. P. pacificus fornisce quindi un sistema modello eccellente con cui analizzare l'evoluzione dei comportamenti nuovi e la loro importanza ecologica.
Al fine di analizzare i comportamenti alimentari predatori in specie di nematodi, come P. pacificus abbiamo sviluppato diversi test comportamentali nuovi per una facile osservazione e la quantificazione delle azioni predatorie. Come P. pacificus mostra una struttura bocca dimorphic, che influenza fortemente il comportamento predatorio, identificazione del morfotipo corretta è essenziale 1,2. La stretta bocca metamorfosi stenostomatous contiene un solo dente dorsale smussato e non svolge alcuna alimentazione predatori. In alternativa, l'ampia bocca metamorfosi eurystomatous include una molto più grande a forma di artiglio dente dorsale e un ulteriore oppostesub-ventrale dente, che insieme operano per aprire in modo efficiente la cuticola delle loro prede. Il rapporto tra la eurystomatous predatori alla forma stenostomatous non predatori varia tra le specie Pristionchus e anche all'interno P. pacificus, tuttavia, la percentuale della bocca eurystomatous trasformarsi in P. pacificus ceppo selvatico (PS312) è di solito 70 – 90% 2. Inoltre, i rapporti di forma della bocca può variare a seconda di diversi fattori ambientali (sia a conoscenza, anche fame e qualche piccola molecola di segnalazione così come i fattori sconosciuti), in tal modo la corretta identificazione e l'isolamento della forma bocca eurystomatous predatori è essenziale per le analisi predatori di successo.
Accanto alla descrizione della forma della bocca predatori abbiamo sviluppato un "saggio morso" per l'osservazione diretta e la quantificazione dei comportamenti predatori, tra cui mordere, uccidendo e alimentando eventi. Qui nematodi prede sono isolati attraverso il filtroing delle culture di recente fame ed esposti a predatori adulti P. pacificus, che si osservano insieme in un breve lasso di tempo. Inoltre, abbiamo anche sviluppato un elevato throughput "saggio cadavere" per facilitare una rapida proiezione di comportamenti predatori attraverso l'osservazione indiretta di eventi predatori. Questo si avvale della presenza di cadaveri larvali come strumento per lo screening per predazione. Entrambi i test forniscono metodi semplici e altamente ripetibili per l'osservazione e la misurazione comportamenti predatori di specie di nematodi, come P. pacificus.
I nematodi forniscono un potente sistema per la comprensione neurobiologia e comportamento con C. elegans finora essere lo strumento principale. Tuttavia, numerose specie di nematodi, tra cui P. comportamenti di visualizzazione pacificus, che sono assenti o variano per complessità dalla organismo modello C. elegans e quindi sollevano questioni interessanti per quanto riguarda l'evoluzione e la regolamentazione di questi comportamenti. Un tale comportamento aggiuntivo trovato in molte altre specie di nematodi inclusi P. pacificus è la capacità di integrare la propria dieta batterica impegnandosi per l'alimentazione degli predatori 1, 20. Per questo motivo abbiamo sviluppato e descritto un protocollo dettagliato per una facile e rapida caratterizzazione di questi comportamenti predatori in precedenza non analizzati in nematodi.
In primo luogo, abbiamo fornito i metodi per lo screening per le variazioni in apparati di alimentazione all'interno della bocca nematode. L'identificazione del tipo corretto bocca è un elemento essenziale prima sTep per le prove di predazione di successo come, almeno all'interno del genere Pristionchus solo gli animali eurystomatous sono in grado di alimentare predatori. E 'meglio identificare bocca si trasforma con il protocollo "rapida bocca fenotipizzazione" descritto nel protocollo 1.2 in quanto questo metodo è molto meno invasivo e quindi è meno probabile che i comportamenti predatori possono essere turbati. Tuttavia, si raccomanda di diventare prima familiarità con le diverse strutture bocca dall'identificazione con animali anestetizzati su pattini di agar (protocollo 1.1).
Dopo l'identificazione del morph bocca desiderato, abbiamo descritto due saggi per quantificare l'alimentazione predatori. Questi sono un rapido, high throughput "assay cadavere" (protocollo 3) ed un altro tempo ma analisi comportamentale più approfondita attraverso il "test morso" (protocollo 2). Entrambi questi protocolli sono altamente flessibile consentendo diverse modifiche al fine di ottimizzare i saggi seconda delle sperirequisiti Tal. Per i saggi morso utilizzando P. predatori pacificus su C. elegans prede, osservazioni delle interazioni comportamentali predatori per una finestra temporale di 10 minuti era sufficiente per quantificare una quantità significativa di punture insieme ad altri eventi alimentazione. Per i "saggi" cadavere ancora una volta utilizzando P. predatori pacificus su C. elegans prede, 5 predatori per 2 ore ha prodotto numeri cadavere facilmente quantificabili e coerenti che consentano una rapida analisi comportamentale. Tuttavia, va notato diverse specie di predatori mossa nematode a velocità diverse, mangiare a velocità diverse e generalmente mostrano una grande diversità in altri comportamenti 1. Inoltre, diverse prede possono essere consumati a velocità diverse per ragioni analoghe. Si raccomanda pertanto di ottimizzare le analisi basate sulle specie di nematodi testati sia come predatori e prede, e anche per le eventuali differenze di condizioni ambientali. Durante entrambi "morso" e "corpie "test è fondamentale che sia prede e predatori sono sani, come sottolineato o predatori feriti non uccideranno in modo efficiente. Inoltre, le piastre test freschi sono essenziali come piatti più anziani possono diventare asciugato che influisce negativamente sulla salute dei nematodi che porta alla erronea saggi. Si spera inoltre che le future iterazioni di questi saggi predatori saranno in grado di sfruttare i recenti progressi nella tecnologia, al fine di automatizzare gran parte delle analisi, come è stato fatto per indagare molti comportamenti osservati in C. elegans 21, 22. Attualmente i problemi possono sorgere nei nematodi, come P. pacificus come appaiono molto più sensibili al contatto, rendendo l'isolamento e l'immobilizzazione in camere microfluidica probabilità di abrogare l'alimentazione predatori. il superamento di questa potrebbe rivelarsi impegnativo, ma faciliterebbe singoli nematodi a essere sottoposti a screening per il sottile predatori comportamenti.
Infine, abbiamo anche fornito metodi FOR esaminando l'apparato di alimentazione nematode stesso facilitando il confronto tra le modalità di alimentazione predatori e batteriche quantificando la cinetica dei denti e della faringe di pompaggio con una macchina fotografica ad alta velocità (protocollo 4). La quantificazione dei tassi faringea di pompaggio in C. elegans è stato utilizzato per monitorare l'alimentazione per molti anni 23, tuttavia, C. elegans è priva di qualsiasi forma di bocca denticle e manca anche comportamenti predatori. Attraverso combinando la quantificazione della faringe pompaggio con quello dell'attività dente, qualsiasi innervazione dei denti specifici predazione può essere anche osservata. A causa l'ingrandimento necessario per osservare il movimento dei denti degli animali muovono spesso fuori del piano focale, quindi è di solito possibile solo osservare il dente per finestre temporali brevi. Inoltre, a differenza C. elegans, la faringe di P. pacificus non continuo della pompa, ma piuttosto si impegna in periodi di pompaggio e l'alimentazione. Pertanto, per un accurato pum faringeacon tempi di risposta mentre l'alimentazione da determinare, è importante registrare 15 secondi di alimentazione continua.
Questi metodi qui presentati forniscono quindi il primo quadro per indagare i comportamenti predatori nei sistemi di nematodi. Inoltre, possono anche essere adattabile per l'impiego nelle indagini altre interazioni all'interno dell'ecosistema nematode tra cui l'influenza di organismi inoltre ecologicamente rilevanti sulla predazione compresi microrganismi, funghi e acari . Così essi forniscono un mezzo per analizzare come questi comportamenti predatori sono regolate, come essi si siano evoluti e anche la loro importanza ecologica.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |