Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
נמטודות עם מערכות העצבים הקטנות אך מורכבות שלהם הוכיחה כלים רבים עצמה להבנת היבטים רבים של לנוירוביולוגיה כולל התנהגות. הרבה של מחקר זה התמקד אורגניזם המודל Caenorhabditis elegans שבו שפע של התנהגויות שונות כבר גזור בהצלחה ונותח. אלה כוללים mechanosensory 3, 4 chemotactic, thermotactic 5,6 ו magnetotactic 7 משפיעי הזדווגות 8,9, למידת 10 והאכלת התנהגויות 11. עם זאת, אחרים יותר מינים נמטודות קרובים רחוקים להציג התנהגויות שאינן שנצפתה rhabditid ג elegans או לחילופין להראות רמות נוספות של מורכבות, מה שמעלה שאלות ענייניות לגבי האבולוציה והרגולציה שלהם. מקרה אחד כזה זה יכול להיות שנצפה נמטודות diplogastrid קרוב רחוק Pristionchus פקיפיקוס, המציג הרבה יותר מורכב האכלה להיותhaviors ומקצבים מאשר הם נצפו ב C. elegans 1. זאת למרות שני המינים שיתוף נוירונים בלוע הומולוגי 12. בד בבד עם הרגלי תזונה נוספים הללו, פ פקיפיקוס מציג גם מגוון תזונתי מורחב, כפי שהם טורפים נלהבים, מסוגלים להשלים דיאטת החיידקים שלהם על ידי ההאכלה גם על הזחלים של נמטודות אחרות. למרבה המזל, פ פקיפיקוס פותח כמודל ביולוגיה האבולוציונית השוואתית ואינטגרטיבית ולכן הרבה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים כעת. אלה כוללים הגנום רצף ובהערות מלאים 13, כלים מולקולריים וגנטיים כולל transgenes 14 ו CRISPR / Cas9 15,16 וכן תולדות גזע מפורטות המבואר גם 17 עם מעל 25 מינים קרובים כולל מיני האחות שהתגלו שלה. בנוסף, האקולוגיה של מינים רבים Pristionchus כולל פ פקיפיקוס היא שאנחנוll מוגדר עם מינים רבים ועכשיו לאחר תואר שיתוף עמותה necromenic עם חיפושיות חיפושית, שורה הם חולקים לעתים קרובות עם מינים אחרים נמטודות 18. פ פקיפיקוס ולכן מספק מערכת מודל מצוינת כדי לנתח את ההתפתחות של התנהגויות רומן והמשמעות האקולוגית שלהם.
על מנת לנתח את הרגלי התזונה הם טורפים במינים נמטודות כגון פ פקיפיקוס פתחו מספר מבחני התנהגות חדשניים התבוננות קלה וכימות של פעולות טורפים. כפי P. פקיפיקוס מציג מבנה פה דימורפית, המשפיע התנהגות טורפים מאוד, זיהוי של morphotype הנכונה הוא 1,2 חיונית. מורף stenostomatous פה הצר מכיל שן גב בוטה יחיד ואינו לעסוק בכל האכלה טורפת. לחלופין, מורף eurystomatous הרחב פה כולל שן גב הרבה יותר גדול בצורת טפר נוסף מנוגדותשן תת-גחון, אשר מפעיל יחדיו כדי לפתוח את לציפורן של טרפם ביעילות. היחס בין eurystomatous טורף לטופס stenostomatous שאינו הטורפים משתנה בין מיני Pristionchus וגם בתוך פ פקיפיקוס, לעומת זאת, אחוז מהפה eurystomatous מורף ב פ סוג זן פראי פקיפיקוס (PS312) הוא בדרך כלל 70 – 90% 2. בנוסף, יחסי טופס פה עשויים להשתנות בהתאם שונה והשפעות סביבתיות (הן ידועות, כוללים הרעבה וכמה מולקולה קטנה איתות כמו גם גורמים לא ידועים), ובכך זיהוי נכון ובידוד של טופס פי eurystomatous טורפים חיוני מבחני טורפים מוצלחים.
לצד התיאור של טופס הפה הטורף פתחנו "assay ביס" להתבוננות ישירה וכימות של התנהגויות טורפים כולל נושך, הרג האכלת אירועים. הנה נמטודות טרף מבודדת באמצעות מסנןing של תרבויות מורעבות חדש נחשף פ מבוגר טורפים פקיפיקוס, אשר הם נצפו יחד במהלך פרק זמן קצר. בנוסף, אנו גם פתחנו "assay גופה" גבוהה תפוקה כדי להקל לסינון מהיר של התנהגות טורפים באמצעות תצפית עקיפה של אירועים טורפים. זו מנצלת את הנוכחות של גופות זחל ככלי למסך הטריפה. מבחני שניהם מספקים שיטות קלות דיר ביותר עבור צפייה למדידת התנהגות טורפים במינים נמטודות כגון פ פקיפיקוס.
נמטודות לספק מערכת רב עוצמה להבנת לנוירוביולוגיה והתנהגות עם ג elegans עד כה להיות הכלי העיקרי. עם זאת, מינים רבים, כולל נמטודות פ התנהגויות תצוגה פקיפיקוס, אשר נעדרות או להשתנות מורכבות מן ג אורגניזם המודל elegans ולכן להעלות שאלות מרתקות לגבי האבולוציה ורגולציה של התנהגויות אלו. אחת התנהגויות נוספות כגון נמצאו במינים נמטודות רבים אחרים, כוללים פ פקיפיקוס הוא היכולת להשלים את תזונת החיידקים שלהם על ידי עוסקי האכלת טורפי 1, 20. יש אפוא פתחנו ותארנו פרוטוקול מפורט לאפיון קל ומהיר של התנהגויות טורפים לא מוסברות בעבר אלה נמטודות.
ראשית, ספקנו שיטות למסך וריאציות האכלת מנגנון בתוך הפה נמטודות. זיהוי של סוג הפה הנכון הוא של חיוני ראשוןTEP עבור מבחני טריפה מוצלחים כמו, לפחות בתוך סוג Pristionchus רק חיות eurystomatous מסוגלות האכלה טורפת. עדיף לזהות פי morphs עם "phenotyping פה המהיר" הפרוטוקול המתואר בפרוטוקול 1.2 כמו שיטה זו היא הרבה פחות פולשני ולכן זה פחות סביר כי התנהגויות טורפים עשויות להיות מוטרדות. עם זאת, מומלץ להכיר הראשונה עם המבנים ושפה ידי הזדהות עם חיות הרדימו על רפידות אגרו (פרוטוקול 1.1).
בעקבות זיהוי של מורף הפה הרצוי, שתארנו שני מבחנים לכימות האכלה טורפת. אלה הם "assay גופה" מהיר, גבוהה תפוקה (פרוטוקול 3) וכן זמן רב יותר אבל יותר מעמיק ניתוח התנהגות הדרך "assay הביס" (פרוטוקול 2). שני פרוטוקולים אלה הם מאוד גמישים המאפשרים מספר שינויים כדי לייעל את מבחני תלוי experimenדרישות טל. עבור מבחני ביס באמצעות פ טורפים פקיפיקוס על ג elegans טרף, תצפיות של אינטראקציות התנהגותיות טורפות עבור חלון זמן של 10 דקות היו די כדי לכמת כמות משמעותית של עקיצות יחד עם אירועי האכלה אחרים. עבור "מבחני גופה" שוב ניצול פ טורפים פקיפיקוס על ג elegans טרף, 5 טורפים עבור שעה 2 מיוצר מספרי גופה לכימות ועקביים בקלות המאפשר ניתוח התנהגות מהיר. עם זאת, יש לציין מינים שונים של מהלך נמטודות טורף במהירויות שונות, לאכול בשיעורים שונים ובאופן כללי להפגין מגוון גדול בהתנהגויות אחרות 1. בנוסף, מיני טרף שונים ניתן לאכול גם בשיעורים שונים מסיבות דומות. לכן מומלץ לבצע אופטימיזציה של המבחנים מבוססים על המינים נמטודות נבדקים הם טורפים ונטרפים, וכן לכל הבדלים בתנאים סביבתיים. במהלך שני "ביס" ו "חילמבחני דואר "זה קריטי, כי הן טרף טורפים הם בריאים, כפי הדגיש או טורפים פצועים לא יהרגו ביעילות. בנוסף, צלחות assay טריות חיוניות כמו צלחות מבוגרים יכול להיות התייבשו אשר משפיעה לרעה על הבריאות של נמטודות המובילה שגוי מבחנים. כמו כן יש לקוות כי שיפורים עתידיים מבחני טורפים אלה יוכלו לנצל את השיפורים האחרונים בטכנולוגיה כדי להפוך את מרבית הניתוח כמו הושג על חקירת התנהגויות רבות שנצפו C. elegans 21, 22. נכון לעכשיו בעיות צפויות להתעורר נמטודות כגון פ פקיפיקוס כפי שהם מופיעים הרבה יותר רגישים כדי ליצור קשר, מה שהופך בידוד וקיבוע בתאי microfluidic עשויים לבטל האכלה טורפת. התגברות זו עשויה להוכיח מאתגר אבל תקל נמטודות פרט שיוקרה עבור מתוחכם טורפים התנהגויות.
לבסוף, יש לנו גם בתנאי שיטות FOr בחינת מנגנון האכלה נמטודות עצמה לסייע להשוואה בין טורפים חיידקי מצבי האכלה על ידי כימות קינטיקה השן השאיבה בלוע באמצעות מצלמה במהירות גבוהה (פרוטוקול 4). כימות של שיעורי השאיבה בלוע ב C. elegans נוצל כדי לפקח האכלה במשך שנים רבות 23, לעומת זאת, ג elegans חסר כל צורה של הפה denticle וגם חסר התנהגויות טורפות. באמצעות שילוב של כימות של בלוע שאיבה עם זה של פעילות שן, כל עצבוב של השיניים ספציפיות טריפה ניתן לצפות גם. בשל ההגדלה הנדרשת כדי להתבונן בתנועת שן החיות לעתים קרובות לעזוב את מישור המוקד, ולכן הוא בדרך כלל רק ניתן לראות את השן עבור חלונות זמן קצרה. בנוסף, שלא כמו ג elegans, הלוע של פ פקיפיקוס לא לשאוב ברציפות, אלא עוסק לחשים של שאיבה והאכלה. לכן, עבור pum בלוע מדויקשיעורי פינג בזמן ההאכלה שייקבעו, חשוב להקליט 15 שניות של האכלה רציפה.
שיטות אלה שהוצגו כאן ולכן מספקות את המסגרת הראשונה על חקירת התנהגויות טורפות במערכות נמטודות. יתר על כן, הם יכולים גם להיות בעל יכולת הסתגלות לשימוש בחקירת אינטראקציות אחרות בתוך המערכת האקולוגית נמטודות כוללת השפעת אורגניזמים רלוונטי גם מבחינה אקולוגית על טריפה כולל מיקרואורגניזמים, פטריות קרדית . לכן הם מספקים אמצעי לנתח כיצד התנהגויות טורפים אלה מוסדרות, וכיצד הם עשויים התפתחו גם המשמעות האקולוגית שלהם.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |