Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
Нематоды с их небольшими, но сложными нервной системы оказались мощными инструментами для понимания многих аспектов нейробиологии включая поведение. Значительная часть этих исследований была сосредоточена на модели организма Caenorhabditis Элеганс , в котором огромное количество различных поведения были успешно расчлененный и проанализированы. К ним относятся механосенсорных 3, хемотаксическая 4, относящийся к терморегуляции 5,6 и 7 влияния на чувствительный к магнитному полю спаривание 8,9, обучение 10 и кормления модели поведения 11. Тем не менее, другие более отдаленно родственных видов нематод отображения поведения , которые не наблюдаются в rhabditid C. Элеганс или альтернативно показать дополнительные уровни сложности, что вызывает соответствующие вопросы , касающиеся их развития и регулирования. Одним из таких примеров этого может наблюдаться в отдаленном родстве diplogastrid нематоды Pristionchus Пасификус, который отображает гораздо более сложным кормление будетhaviors и ритмы , чем наблюдаются в С. Элеганс 1. И это несмотря на два вида обмена гомологичных глоточные нейронов 12. Одновременно с этим дополнительным поведением кормления, P. расШсиз также отображает расширенную диетический диапазон, так как они являются заядлыми хищников, способных дополнять их бактериальное диету, также питаются личинками других нематод. К счастью, П. расШсиз была разработана в качестве модели для сравнительной и эволюционной биологии интегративной и поэтому многие молекулярные и генетические инструменты теперь доступны. Они включают в себя полностью виртуализированного и аннотированный геном 13, молекулярные и генетические инструменты , в том числе трансгенов 14 и CRISPR / cas9 15,16, а также подробное и хорошо аннотированный филогении 17 с более чем 25 близкородственных видов , включая его недавно обнаруженных видов сестра. Кроме того, экология многих видов Pristionchus включая P. расШсиз это мыLL определяется многими видами того , в настоящее время описано обмена necromenic ассоциации с жуки – скарабеи, множество они часто делиться с другими видами 18 нематод. П. Поэтому расШсиз обеспечивает прекрасную модельную систему , с помощью которой рассекать эволюцию новых видов поведения и их экологическое значение.
Для того чтобы проанализировать поведение грабительские кормления в видов нематод , таких как P. расШсиз мы разработали несколько новых поведенческих анализов для удобства наблюдения и количественной оценки грабительских действий. Как P. расШсиз отображает диморфной структуру рта, которая сильно влияет на хищническое поведение, идентификация правильного морфотипу имеет важное значение 1,2. Узкая горлышком stenostomatous морфом содержит один тупой спинной зуб и не участвует в какой-либо хищного кормления. С другой стороны, широкий рот eurystomatous морфом включает в себя гораздо большую форму когтя спинной зуб и дополнительный противк югу от вентральной зуба, которые вместе работают эффективно открыть кутикулу своей добычи. Отношение хищного eurystomatous к нехищной stenostomatous форме варьирует у разных видов Pristionchus , а также в пределах P. расШсиз, однако, процент eurystomatous рта трансформироваться в P. расШсиз штамм дикого типа (PS312), как правило , 70 – 90% 2. Кроме того, коэффициенты формы рта могут колебаться в зависимости от различных воздействий окружающей среды (как известно, в том числе голод и некоторые небольшие молекулы сигнализации, а также неизвестных факторов), таким образом правильную идентификацию и изоляцию хищного eurystomatous формы рта имеет важное значение для успешного проведения захватнических анализов.
Наряду с описанием хищного формы рта мы разработали "Bite анализа" для непосредственного наблюдения и количественной оценки грабительских поведения, включая кусает, убивая и подкормки события. Здесь жертва нематоды изолированы через фильтрфлу- вновь голодали культур и подвергаются хищный взрослых P. расШсиз, которые наблюдаются вместе в течение короткого промежутка времени. Кроме того, мы также разработали высокой пропускной способностью "труп анализа" для облегчения быстрого скрининга хищнического поведения путем косвенного наблюдения за хищными событий. Это имеет преимущество при наличии личиночной трупов в качестве инструмента для скрининга хищничества. Оба анализа обеспечивают легкое и очень воспроизводимые методы для наблюдения и измерения хищнического поведения у видов нематод , таких как P. расШсиз.
Нематоды обеспечивают мощную систему для понимания нейробиологии и поведения с C. Элеганс до сих пор является основным инструментом. Тем не менее, многочисленные виды нематод , включая P. Пасификус дисплей поведения, которые отсутствуют или изменяются в сложности от модельного организма C. Элеганс и , следовательно , повысить увлекательные вопросы , касающиеся развития и регулирования этих видов поведения. Одним из таких дополнительных поведение во многих других видов нематод , включая P. расШсиз является способность в дополнение к их бактериальное диету, занимаясь хищного кормления 1, 20. Поэтому мы разработали и описали подробный протокол для легкой и быстрой характеристики этих ранее непроанализированных грабительских поведения в нематод.
Во-первых, мы предусмотрели методы скрининга изменений в питании аппарата в пределах нематод рта. Определение правильного типа рта является важным первым sТЭП для успешных анализов хищничества , как, по крайней мере , в пределах рода Pristionchus только eurystomatous животные способны хищного кормления. Лучше всего, чтобы определить рот морфы с протоколом "быстрый рот фенотипирования», описанного в протоколе 1.2, поскольку этот метод является гораздо менее агрессивна и, следовательно, менее вероятно, что хищные поведение может быть возмущенных. Тем не менее, рекомендуется сначала ознакомиться с различными структурами рта путем идентификации с наркотизированных животных на чашках с колодками (протокол 1.1).
После идентификации нужного морфом рта, мы описали два анализы для количественного определения хищный кормления. Это быстрый, высокая пропускная способность "Труп анализа" (протокол 3) и больше времени, но поведенческий анализ более глубокий через "Bite анализа" (протокол 2). Оба эти протокола являются весьма гибкими позволяет для различных модификаций с целью оптимизации анализов в зависимости от экспериментальТребования к ментальные. Для укуса анализов с использованием P. Пасификус хищников на C. Элеганс добычей, наблюдения хищных поведенческих взаимодействий для временного окна 10 мин было достаточно , чтобы количественно оценить значительное количество укусов наряду с другими событиями кормления. Для "трупные анализов" снова с использованием P. Пасификус хищников на C. Элеганс добычей, 5 хищников в течение 2 ч производится легко поддающиеся количественному определению и последовательные номера трупа , позволяющие для быстрого поведенческого анализа. Тем не менее, следует отметить различные виды хищных нематод двигаться с разной скоростью, едят с разной скоростью и в целом демонстрируют большое разнообразие в другие виды поведения 1. Кроме того, различные виды добычи также может быть съеден с разной скоростью по аналогичным причинам. Поэтому рекомендуется, чтобы оптимизировать анализы, основанные на испытанных видов нематод как в качестве хищников и добычи, а также для любых различий в условиях окружающей среды. Во время обоих "Bite" и "корпусе "анализы очень важно, чтобы обе жертвы и хищники здоровы, как подчеркивает или травмированных хищников не будет убивать эффективно. Кроме того, свежие аналитические планшеты имеют важное значение, как более старые пластин могут стать высохли что негативно сказывается на здоровье нематод приводит к ошибочным анализы. Следует также надеяться , что будущие итерации этих грабительских анализов смогут воспользоваться преимуществами последних достижений в области технологий для того , чтобы автоматизировать большую часть анализа , как было сделано для исследования поведения многих наблюдаемых в C. Элеганс 21, 22. в настоящее время проблемы могут возникнуть у нематод , таких как П. расШсиз , как они появляются гораздо более чувствительны к контакту, делая изоляцию и иммобилизации в микрофлюидальных камерах, способных отменяют хищный вскармливание. Преодоление это может оказаться сложной задачей , но будет способствовать отдельных нематод, отбираемые на более тонкие хищная поведения.
Наконец, мы также предоставили методы Foг изучения устройства нематода кормления сам облегчающую сравнения между хищными и бактериальным режимов кормления с помощью количественного анализа кинетики зуба и глоточной накачки с помощью камеры высокоскоростной (протокол 4). Количественное скоростей глоточной накачки в C. Элеганс был использован для мониторинга кормления в течение многих лет 23, тем не менее, С. Элеганс не хватает какой – либо форме рта зубец , а также не хватает грабительские поведения. Через объединение количественной оценки глоточной накачки с этим зубной активности, может также наблюдаться любые иннервации зубов, характерных для хищничества. В связи с увеличением требуемого для наблюдения за перемещением зуба животные часто перемещаются из фокальной плоскости, таким образом, как правило, можно только наблюдать за зуб за коротких временных окон. Кроме того, в отличие от С. Элеганс, глотка Р. расШсиз не непрерывно прокачивать, а он участвует в заклинаниях накачкой и кормления. Поэтому для точного глоточной ГПМставки пинг во время кормления, чтобы определить, необходимо записать 15 с непрерывной подачей.
Таким образом , эти методы , представленные здесь , обеспечивают первую основу для исследования грабительские поведения в системах нематод. Кроме того, они также могут быть адаптированы для использования при изучении других взаимодействий внутри нематод экосистемы , включая влияние дополнительно экологически соответствующих организмов на хищничество включая микроорганизмы, грибы и клещей , Таким образом, они дают возможность препарировать, как эти хищные формы поведения регулируются, как они, возможно, развивались, а также их экологическое значение.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |