Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
Nematoden mit ihren kleinen, aber komplexen Nervensysteme haben für das Verständnis vieler Aspekte der Neurobiologie einschließlich des Verhaltens leistungsfähige Werkzeuge bewährt. Ein großer Teil dieser Forschung hat sich auf dem Modellorganismus Caenorhabditis elegans konzentriert , in denen eine Fülle von unterschiedlichen Verhaltensweisen erfolgreich seziert und analysiert. Dazu gehören mechanosensorischen 3, chemotaktische 4, thermotactic 5,6 und magnetotactic 7 Beeinflussung der Paarung 8,9, das Lernen 10 und Fütterung Verhaltensweisen 11. Aber auch andere mehr weitläufig verwandt Nematodenarten zeigen Verhaltensweisen , die nicht in der rhabditid C beobachtet elegans oder zeigen alternativ zusätzliche Ebenen der Komplexität, die in Bezug auf ihre Entwicklung und Regulierung relevanten Fragen aufwirft. Eine solche Instanz kann dies in der entfernt verwandten diplogastrid Nematoden Pristionchus pacificus, beobachtet werden , die Fütterung viel komplexer zeigt seinhaviors und Rhythmen als in C beobachtet werden elegans 1. Dies ist trotz der beiden Arten homologe Rachen Neuronen 12 zu teilen. Zeitgleich mit dieser zusätzlichen Fütterungsverhalten, P. pacificus zeigt auch ein Ernährungsprogramm erweitert, da sie eifriger Räuber sind, der fähig ist , ihre bakterielle Ernährung zu ergänzen , indem auch auf die Larven anderer Nematoden ernähren. Zum Glück, P. pacificus wurde für vergleichende und integrative Evolutionsbiologie und deshalb viele molekulare und genetische Werkzeuge sind jetzt als Modell entwickelt. Dazu gehören ein vollständig sequenzierten und kommentierte Genom 13, molekularen und genetischen Werkzeuge einschließlich Transgene 14 und CRISPR / Cas9 15,16 sowie eine detaillierte und gut kommentierten Phylogenie 17 mit über 25 eng verwandten Arten einschließlich der neu entdeckten Schwesterarten. Darüber hinaus, auch die Ökologie der zahlreichen Pristionchus Arten P. pacificus ist , dass wirll mit vielen Arten definiert haben nun beschrieben eine necromenic Verbindung mit Skarabäen teilen, einen Wirt sie häufig mit anderen Nematodenarten 18 teilen. P. pacificus bietet daher ein ausgezeichnetes Modellsystem , mit dem die Entwicklung neuer Verhaltensweisen und ihre ökologische Bedeutung zu sezieren.
Um Raub Fütterung Verhalten in Nematodenarten wie P. zu analysieren pacificus wir mehrere neue Verhaltenstests für die einfache Beobachtung und Quantifizierung von räuberischen Aktionen entwickelt. Als P. pacificus zeigt eine dimorphic Mund – Struktur, die stark räuberische Verhalten beeinflusst, die Identifizierung des korrekten Morphotyp wesentliche 1,2 ist. Der schmale Mund stenostomatous Morph enthält einen einzigen stumpfen Dorsalzahn und beteiligt sich nicht an Verdrängungs Fütterung. Alternativ umfasst die breiten Mund eurystomatous morph eine viel größere claw förmigen dorsal Zahn und einen zusätzlichen entgegenUnter ventralen Zahn, die zusammen arbeiten effizient die Kutikula ihrer Beute zu öffnen. Das Verhältnis des räuberischen eurystomatous auf die nicht räuberischen stenostomatous Form variiert unter Pristionchus Arten und auch innerhalb P. pacificus jedoch morphen der Anteil der eurystomatous Mund im P. pacificus Wildtyp – Stamm (PS312) ist in der Regel 70 bis 90% 2. Zusätzlich können die Mundform Verhältnisse auf unterschiedliche Umwelteinflüsse schwanken kann (beide bekannt sind, einschließlich Hunger und einige kleine Molekül sowie unbekannte Faktoren signalisieren), so dass eine korrekte Identifizierung und Isolierung des räuberischen eurystomatous Mund Form ist entscheidend für die erfolgreiche räuberische Assays.
Neben der Beschreibung der räuberischen Mund Form haben wir einen "Biss-Test" für die direkte Beobachtung und Quantifizierung von räuberischen Verhalten einschließlich Beißen entwickelt, die Tötung und Fütterung Ereignisse. Hier Beute Nematoden sind getrennt durch Filtering neu ausgehungert Kulturen und zu räuberischen Erwachsenen P. ausgesetzt pacificus, die zusammen über eine kurze Zeitspanne eingehalten werden. Darüber hinaus haben wir auch einen hohen Durchsatz "Leiche Test" entwickelt, um ein schnelles Screening von räuberischen Verhalten durch indirekte Beobachtung der räuberischen Ereignisse erleichtern. Dies nutzt die Anwesenheit von larvalen Leichen als Werkzeug für predation zu screenen. Beide Assays bieten eine einfache und hoch reproduzierbare Methoden zur Beobachtung und räuberische Verhalten in Nematodenarten wie P. Mess pacificus.
Nematoden bieten ein leistungsfähiges System für das Verständnis der Neurobiologie und Verhalten mit C. elegans ist bisher das wichtigste Werkzeug. Doch zahlreiche Nematodenarten einschließlich P. pacificus Anzeigeverhalten, die nicht vorhanden sind oder variieren in Komplexitäten aus dem Modellorganismus C. elegans und deshalb erhöhen faszinierende Fragen in Bezug auf die Entwicklung und die Regulierung dieser Verhaltensweisen. Ein solches zusätzliches Verhalten in vielen anderen Nematodenarten einschließlich P. gefunden pacificus ist die Fähigkeit , ihre bakterielle Ernährung zu ergänzen durch 1 in räuberische Fütterung Eingriff, 20. Daher haben wir entwickelt und beschrieben ein detailliertes Protokoll für eine einfache und schnelle Charakterisierung dieser bisher nicht analysierte räuberische Verhalten in Nematoden.
Erstens haben wir Methoden zur Verfügung gestellt in der Fütterung Apparat innerhalb der Nematoden Mund für Variationen zu screenen. Die Identifizierung der richtigen Mund Typ ist ein erster wichtiger step für eine erfolgreiche predation Assays wie, zumindest innerhalb der Pristionchus Gattung nur eurystomatous Tiere fähig ist räuberischen Fütterung sind. Es ist am besten zu identifizieren Mund mit dem "schnellen Mund Phänotypisierung" Protokoll in Protokoll 1.2, da dieses Verfahren beschrieben Morphs ist viel weniger invasiv und daher ist es weniger wahrscheinlich, dass räuberische Verhalten gestört werden kann. Es wird jedoch empfohlen, zuerst mit den verschiedenen Mundstrukturen durch Identifikation mit anästhesierten Tieren auf Agar pads (Protokoll 1.1) vertraut.
Nach der Identifizierung der gewünschten Mund morph, haben wir zwei Assays beschriebenen Verdrängungsfütterungs zur Quantifizierung. Es handelt sich um ein schnelles, mit hohem Durchsatz "Leiche Assay" (Protokoll 3) und einer mehr zeitaufwendig, sondern mehr in die Tiefe Verhaltensanalyse durch den "Biss-Test" (Protokoll 2). Beide Protokolle sind sehr flexibel, so dass mehrere Modifikationen, um die Tests in Abhängigkeit von den experimen zu optimierental Anforderungen. Für Biss Assays P. mit pacificus Räuber auf C. elegans Beute, Beobachtungen von räuberischen Verhaltens – Interaktionen für ein Zeitfenster von 10 Minuten war ausreichend , um eine erhebliche Menge an Bissen zusammen mit anderen Fütterung Ereignisse zu quantifizieren. Für "Leiche Assays" wieder P. Verwendung pacificus Räuber auf C. elegans Beute, 5 Räuber für 2 Stunden produziert leicht zu quantifizieren und konsistente Zahlen Leiche für eine schnelle Verhaltensanalyse ermöglicht. Es sollte jedoch verschiedene Arten von räuberischen Nematoden bewegen sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten zu beachten, essen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und in der Regel eine große Vielfalt in andere Verhaltensweisen 1 zeigen. Zusätzlich können verschiedene Beutearten auch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aus ähnlichen Gründen gegessen werden. Es wird deshalb empfohlen, die Tests empfohlen, auf die Nematodenarten getestet sowohl als Räuber und Beute, und auch für alle Unterschiede in den Umweltbedingungen auf Basis zu optimieren. Während beide "Biss" und "Corpse "Assays ist es entscheidend, dass sowohl Beute und Räuber gesund sind, werden wie gestresst oder verletzt Räuber nicht effizient töten. Außerdem sind frische Testplatten wesentlich ältere Platten ausgetrocknet werden kann, was sich negativ auf die Gesundheit der Nematoden wirkt sich auf fehlerhafte führende Assays. Es ist zu hoffen , dass auch künftige Iterationen dieser räuberischen Assays Lage , die Vorteile der jüngsten Fortschritte in der Technologie , um viel von der Analyse zu automatisieren wie ausgeführt wurde in C zu nehmen sein wird elegans 21, 22 beobachtet viele Verhaltensweisen für die Untersuchung. zur Zeit Probleme in Nematoden entstehen dürften, wie P. pacificus , da sie viel empfindlicher zu kontaktieren, so dass die Isolierung und Immobilisierung in mikrofluidischen Kammern wahrscheinlich räuberischen Fütterung abschaffen erscheinen. Die Überwindung dieser Herausforderung erweisen können würde , aber einzelne Nematoden erleichtern , um für subtilere räuberische gescreent werden Verhaltensweisen.
Schließlich haben wir auch vorgesehen Verfahren for Prüfung der Nematode Zuführungsvorrichtung selbst Vergleiche zwischen den räuberischen und bakteriellen Zufuhrmodi zu erleichtern, indem die Zahn und Rachenpump Kinetik Quantifizierung einer Hochgeschwindigkeitskamera mit (Protokoll 4). Die Quantifizierung der Schlundpumpraten in C. elegans wurde Fütterung seit vielen Jahren zur Überwachung genutzt 23, jedoch C. elegans fehlt jede Form von Mund denticle und es fehlt auch räuberische Verhalten. Durch die Quantifizierung der Rachen mit der Zahn Aktivität, jede Innervation der Zähne spezifisch predation Pumpen kombinieren kann ebenfalls beobachtet. Aufgrund der Vergrößerung der Zahnbewegung zu beobachten erforderlich die Tiere oft aus der Fokusebene zu bewegen, so ist es in der Regel nur möglich, den Zahn für kurze Zeitfenster zu beobachten. Außerdem, im Gegensatz zu C. elegans, des Rachens von P. pacificus nicht kontinuierlich pumpen, sondern greift es in Phasen der Pump und Fütterung. Daher ist für eine genaue pharyngealen PUMwährend der Fütterung Ping-Raten bestimmt werden, ist es wichtig, 15 Sekunden kontinuierlicher Zuführung aufzuzeichnen.
Diese hier vorgestellten Methoden bieten daher den ersten Rahmen für die räuberische Verhalten in Nematoden Systeme zu untersuchen. Darüber hinaus können sie auch anpassungsfähig sein , für den Einsatz bei der Untersuchung anderer Wechselwirkungen innerhalb des Nematoden – Ökosystem einschließlich des Einflusses von zusätzlich ökologisch relevanten Organismen auf predation einschließlich Mikroorganismen, Pilzen und Milben . So bieten sie ein Mittel zu sezieren, wie diese räuberische Verhalten geregelt werden, wie sie sich entwickelt haben und auch ihre ökologische Bedeutung.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |