Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
وقد أثبتت الديدان الخيطية مع الجهاز العصبي صغيرة ولكنها معقدة من أدوات قوية لفهم العديد من جوانب علم الأعصاب بما في ذلك السلوك. وقد ركزت معظم هذه البحوث على الكائن الحي نموذج ايليجانس انواع معينة فيها مجموعة كبيرة من السلوكيات مختلفة تم تشريح بنجاح وتحليلها. وتشمل هذه ميكانيكية حسية 3، 4 الكيميائي، منجذب للحرارة 5،6 وmagnetotactic 7 التأثير على التزاوج 8،9، والتعلم 10 و التغذية السلوكيات 11. ومع ذلك، عرض أنواع النيماتودا الأخرى ذات الصلة أكثر بعيدة السلوكيات التي لا تراعى في rhabditid C. ايليجانس أو بدلا من ذلك تظهر مستويات إضافية من التعقيد، مما يثير التساؤلات ذات الصلة بشأن تطور وتنظيمها. أحد الأمثلة على ذلك يمكن ملاحظتها في الديدان الخيطية diplogastrid بعيدة الصلة Pristionchus pacificus، والذي يعرض أكثر تعقيدا التغذية يكونhaviors والإيقاعات من لوحظ في C. ايليجانس 1. هذا على الرغم من النوعين تقاسم الخلايا العصبية البلعوم المتجانسة (12). وبالتزامن مع هذه السلوكيات تغذية إضافية، P. يعرض pacificus أيضا مجموعة والغذائية الموسعة، كما هي الحيوانات المفترسة متعطشا، قادرة على استكمال نظامهم الغذائي البكتيري عن طريق تغذية أيضا على يرقات الديدان الأخرى. لحسن الحظ، P. وقد تم تطوير pacificus كنموذج لعلم الأحياء التطوري المقارن والتكاملي، وبالتالي العديد من الأدوات الجزيئية والجينية متوفرة الآن. وتشمل هذه التسلسل الكامل والمشروح الجينوم 13، الأدوات الجزيئية والجينية بما في ذلك الجينات المحورة 14 و كريسبر / Cas9 15،16 فضلا عن نسالة مفصلة ومشروحة بشكل جيد 17 مع أكثر من 25 نوعا وثيق الصلة بما في ذلك الأنواع شقيقة اكتشف حديثا. بالإضافة إلى ذلك، علم البيئة من العديد من الأنواع Pristionchus بما في ذلك P. pacificus هو أنناوقد تم الآن وصف ليرة لبنانية محددة مع العديد من الأنواع تقاسم جمعية necromenic مع الخنافس الجعل، مضيفة أنهما يشتركان في كثير من الأحيان مع أنواع النيماتودا أخرى 18. ب. بالتالي يوفر pacificus نظام نموذجا ممتازا التي لتشريح تطور السلوكيات الجديدة وأهميتها البيئية.
من أجل تحليل سلوكيات التغذية المفترسة في أنواع النيماتودا مثل P. pacificus وضعنا عدة فحوصات السلوكية جديدة لمراقبة سهلة وتقدير من الإجراءات المفترسة. كما P. يعرض pacificus بنية الفم ديمبرافيك، الأمر الذي يؤثر بشدة سلوك المفترسة، وتحديد نمط شكلي الصحيح ضروري 1،2. يحتوي ضعهن stenostomatous الفم ضيق واحد الأسنان ظهري حادة ولا تشارك في أي تغذية المفترسة. بدلا من ذلك، يتضمن ضعهن eurystomatous الفم واسعة مخلب شكل أكبر من ذلك بكثير الأسنان ظهري ومبلغ إضافي معارضةالأسنان الفرعية بطني، والتي تعمل معا لفتح بكفاءة إهاب من فرائسها. تختلف نسبة eurystomatous المفترسة إلى النموذج stenostomatous غير المفترسة بين الأنواع Pristionchus وأيضا داخل P. pacificus، ومع ذلك، فإن نسبة من الفم eurystomatous تتحول في في P. pacificus البرية نوع سلالة (PS312) هو عادة 70-90٪ 2. بالإضافة إلى ذلك، نسب شكل الفم يمكن أن تتقلب حسب اختلاف التأثيرات البيئية (وكلاهما معروف، بما في ذلك الموت جوعا وبعض جزيء صغير يشير فضلا عن عوامل غير معروفة)، وتحديد بالتالي الصحيح وعزل شكل الفم eurystomatous المفترسة أمر ضروري لفحوصات المفترسة ناجحة.
جنبا إلى جنب مع وصف لشكل الفم المفترسة وضعنا "فحص لدغة" لالملاحظة المباشرة وتقدير من السلوكيات المفترسة بما في ذلك عض، مما أسفر عن مقتل وتغذية الأحداث. هنا يتم عزل النيماتودا فريسة من خلال فلترجي الثقافات تجويع حديثا ويتعرض إلى الكبار المفترسة P. pacificus، الذي لوحظ معا خلال فترة زمنية قصيرة. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وضعنا أيضا عالية الإنتاجية "فحص الجثة" لتسهيل الفحص السريع للسلوك المفترسة من خلال الملاحظة المباشرة للأحداث المفترسة. هذا يستفيد من وجود جثث اليرقات كأداة للكشف عن الافتراس. توفر كل من المقايسات طرق سهلة وقابلة للتكرار للغاية لمراقبة وقياس السلوك المفترسة في أنواع النيماتودا مثل P. pacificus.
توفر الديدان الخيطية نظام قوي لفهم بيولوجيا الأعصاب والسلوك مع C. ايليجانس يجري حتى الآن الأداة الرئيسية. ومع ذلك، أنواع النيماتودا عديدة من بينها P. السلوكيات عرض pacificus، والتي هي غائبة أو تختلف في تعقيدات من نموذج حي C. ايليجانس وبالتالي تثير تساؤلات مثيرة حول تطور وتنظيم هذه السلوكيات. واحد مثل هذا السلوك إضافية وجدت في العديد من أنواع الديدان الأخرى بما في ذلك P. pacificus هو القدرة على تكملة نظامهم الغذائي البكتيري من خلال الانخراط في التغذية المفترسة 1، 20. لقد ولذا وضعت ووصف بروتوكول مفصلة لتوصيف السهل والسريع لهذه السلوكيات المفترسة unanalyzed سابقا في الديدان الخيطية.
أولا، قدمنا طرق للكشف عن تغيرات في تغذية الجهاز داخل الفم الخيطية. تحديد نوع الفم الصحيح هو أول أساسيتيب لفحوصات الافتراس ناجحة، على الأقل داخل جنس Pristionchus فقط الحيوانات eurystomatous قادرة على تغذية المفترسة. فمن الأفضل لتحديد الفم تأخذ أشكالا مختلفة مع بروتوكول "السريع phenotyping الفم" وصفت في بروتوكول 1.2 لأن هذا الأسلوب هو أقل الغازية من ذلك بكثير، وبالتالي فإنه من غير المحتمل أن السلوكيات المفترسة قد أقلقت. ومع ذلك، فمن المستحسن أن تصبح أول مألوفة مع هياكل الفم مختلفة من التماهي مع الحيوانات تخدير على منصات أجار (بروتوكول 1.1).
وبعد التعرف على ضعهن الفم المطلوبة، التي وصفناها تحليلين لقياس التغذية المفترسة. هذه هي السريع، وإنتاجية عالية "فحص الجثة" (بروتوكول 3) والمزيد من الوقت طويلا ولكن أكثر تعمقا التحليل السلوكي من خلال "فحص لدغة" (بروتوكول 2). كل من هذه البروتوكولات هي درجة عالية من المرونة مما يسمح لعدة تعديلات من أجل تحسين فحوصات اعتمادا على التجربهمتطلبات التل. لفحوصات دغة باستخدام P. الحيوانات المفترسة pacificus على C. ايليجانس فريسة، وكانت الملاحظات من التفاعلات السلوكية المفترسة لنافذة زمنية من 10 دقيقة كافية لتحديد كمية كبيرة من لدغات جنبا إلى جنب مع الأحداث التغذية الأخرى. ل "فحوصات جثة" مرة أخرى باستخدام P. الحيوانات المفترسة pacificus على C. ايليجانس فريسة، 5 الحيوانات المفترسة لمدة 2 ساعة أنتجت أرقام جثة قابلة للقياس بسهولة ومتسق يتيح للالتحليل السلوكي السريع. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنواع مختلفة من الخطوة النيماتودا المفترسة بسرعات مختلفة، وتناول الطعام بمعدلات مختلفة وعموما يبرهن على وجود تنوع كبير في السلوكيات الأخرى 1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تؤكل أنواع الفرائس المختلفة بمعدلات مختلفة لأسباب مشابهة. لذا فمن المستحسن لتحسين فحوصات استنادا إلى أنواع النيماتودا اختبارها على حد سواء والحيوانات المفترسة والفرائس، وأيضا عن أي اختلافات في الظروف البيئية. خلال كل من "لدغة" و "فيلقه "المقايسات فمن الأهمية بمكان أن كلا فريسة الحيوانات المفترسة ويتمتعون بصحة جيدة، كما أكد أو والحيوانات المفترسة جرح لا تقتل بكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، لوحات فحص جديدة ضرورية لوحات كبار السن يمكن أن تصبح جفت الذي يؤثر سلبا على صحة النيماتودا مما يؤدي إلى خاطئ المقايسات. ومن المأمول أيضا أن التكرار في المستقبل من هذه المقايسات المفترسة سوف تكون قادرة على الاستفادة من التطورات الحديثة في مجال التكنولوجيا من أجل أتمتة الكثير من التحليلات كما تم انجازه لتحقيق العديد من السلوكيات التي لوحظت في C. ايليجانس 21 و 22. وفي الوقت الراهن ومن المحتمل أن تنشأ في الديدان الخيطية مثل P. pacificus المشاكل كما تظهر أكثر حساسية في الاتصال، مما يجعل العزلة والشلل في غرف ميكروفلويديك المرجح أن تلغي التغذية المفترسة. التغلب على هذا قد يكون صعبا ولكن من شأنه أن يسهل الديدان الخيطية الفردية ليتم عرضه للدهاء المفترسة السلوكيات.
وأخيرا، قدمنا أيضا طرق FOص فحص جهاز التغذية الخيطية نفسه تسهيل المقارنات بين أوضاع التغذية المفترسة والبكتيرية عن طريق قياس الأسنان وضخ البلعوم حركية باستخدام كاميرا عالية السرعة (بروتوكول 4). القياس الكمي لمعدلات البلعوم الضخ في C. وقد استخدمت ايليجانس لمراقبة التغذية لسنوات عديدة 23، ومع ذلك، C. ايليجانس تفتقر إلى أي شكل من أشكال سنينة الفم وأيضا تفتقر إلى السلوكيات المفترسة. من خلال الجمع بين تقدير من بلعومي ضخ مع أن النشاط الأسنان، أي تعصيب للأسنان محددة لالافتراس يمكن ملاحظتها أيضا. ويرجع ذلك إلى التكبير المطلوبة لمراقبة حركة الأسنان الحيوانات في كثير من الأحيان الخروج من الطائرة الاتصال، وبالتالي من الممكن عادة فقط لمراقبة الأسنان للنوافذ زمنية قصيرة. بالإضافة إلى ذلك، على عكس C. ايليجانس، البلعوم من P. pacificus لا تضخ بشكل مستمر، بل يشارك في فترات الضخ والتغذية. لذلك، لدقيق الم البلعوممعدلات بينغ في حين تغذية يحدد لاحقا، فمن المهم لتسجيل 15 ثانية من تغذية مستمرة.
وبالتالي، توفر هذه الأساليب المقدمة هنا في الإطار الأول للتحقيق في السلوكيات المفترسة في أنظمة الخيطية. وعلاوة على ذلك، فإنها قد تكون أيضا قابلة للتكيف لاستخدامها في التحقيق في التفاعلات الأخرى داخل النظام الإيكولوجي الخيطية بما في ذلك تأثير الكائنات الحية بالإضافة إلى ذلك ذات الصلة من الناحية البيئية على الافتراس بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة والفطريات والعث . وبالتالي فإنها توفر وسيلة لتشريح كيف يتم تنظيم هذه السلوكيات المفترسة، وكيف أنها قد تطورت وأيضا أهمية البيئية.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |