Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
Las plantas vasculares se basan en capas extracelulares que funcionan como barreras impermeables entre tejidos de las plantas y el medio ambiente externo. Estas estructuras de la pared asociada de células lipófilo restringen la infección patógena y regulan el transporte pasivo de los gases, el agua y las sustancias disueltas dentro y fuera de los tejidos vegetales 1. Estas barreras son la cutícula de la planta, una estructura synapomorphic única de plantas 2, y diferentes barreras de difusión que contiene suberina. La cutícula es una capa oleófilo sintetizado por las células epidérmicas y unido a ellos a través de una capa pectináceo en el lado extracelular de la pared celular 3-5. Se recubre los órganos aéreos primarios de las plantas superiores, que funciona como una interfaz vital entre tejidos de las plantas y el medio ambiente.
Cutina, la matriz estructural de la cutícula, y suberina son dos poliésteres glicerolípido insolubles asociados con ceras disolvente extraíbles 2,4. Estos l poliméricoipids se componen de derivados de ácidos grasos saturados e insaturados y son tanto estructural como funcionalmente similar. Sin embargo, son distinguibles por diferencias características en los sitios de composición y deposición química.
Suberina es un poliéster alifático situado dentro de las paredes celulares de ciertos tejidos internos y externos que forman una pared secundaria. Tejidos suberizadas incluyen periderms de raíces, tubérculos y cortezas de árboles, endodermis de la raíz, capas de revestimiento de semillas, y las heridas cicatrizadas 2. A diferencia de la cutina, el poliéster suberina típicamente contiene alcoholes saturados y ácidos dicarboxílicos mono-insaturados, y una gran proporción de los monómeros de cadena muy larga (C≥20).
Cutina es el más abundante de poliéster de lípidos en plantas vasculares 6, y se compone de glicerol y C16-C18 derivados de ácidos grasos interesterificada, tales como ácidos grasos hidroxi e hidroxi-epoxi sustituido 4. Mientras que la composición de polímeros cutinavaría entre especies tracheophyte, los monómeros primarios más predominantes son 10, 16-dihidroxi 16: 0, 18-hidroxi-9,10-epoxi 18: 0 y 9,10,18-trihidroxi 18: 0 ácidos grasos. Curiosamente, Arabidopsis hoja y tallo cutina se componen principalmente de 18: 2 de ácido dicarboxílico 7,8.
Cutículas vegetales también presentan una variabilidad considerable en el espesor, que van desde unos pocos nanómetros a varios micrómetros 9. Desde el aislamiento de la cutícula es un paso laborioso y consume mucho tiempo, en particular para las cutículas de hojas muy delgadas, tales como los de Arabidopsis thaliana 8, los métodos que evitan el aislamiento de la cutícula se han desarrollado y validado 7,8. Aquí se describe un protocolo detallado para estudiar la composición de monómeros de cutina en hojas de Arabidopsis thaliana por metóxido sódico (NaOMe) despolimerización catalizada y / espectrometría de masas cromatografía de gases subsiguiente (GC / MS) análisis. Este protocolo ofrece un método robusto para ensayar la composition de poliésteres de lípidos en los tejidos de plantas deslipidada enteros, y ha sido adaptado de protocolos previamente reportados 7,10,11. Muestras de tejidos enteros son primero homogeneizada y exhaustivamente sin lípidos, la eliminación de los lípidos en disolventes extraíble incluyendo cuticular y ceras epicuticulares, lípidos de membrana, y triglicéridos. Residuos de la pared enriquecida de células son luego despolimerizan en sus monómeros de éster de metilo de sodio constituyentes por metanolisis catalizada por metóxido. Grasos ésteres metílicos de ácidos se extraen tras la acidificación, y derivatizarse para obtener sus derivados trimetilsililo o acetilo correspondientes. Residuos derivatizados son muy volátiles, y pueden eluirse de una columna de cromatografía de gases a una temperatura razonable sin alterar su conformación estructural durante el análisis GC / MS.
A diferencia de otros biopolímeros tales como ADN y proteínas, lípidos poliésteres planta no están hechos de una plantilla. En cambio, sus composiciones dependen de la especificidad de las enzimas presentes en los tejidos que hacen que estos polímeros extracelulares. Como analiza tal, química del componente componentes son fundamentales para entender la composición de poliéster de lípidos.
Los métodos químicos para escindir enlaces éster incluyen saponificación, hidrogenolisis, transmetilación catalizada por ácido, y catalizada por base de transmetilación 2. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas. La saponificación produce hidroxi ácidos grasos libres que pueden sufrir reacciones secundarias. La hidrogenólisis con hidruro de litio y aluminio (LiAlH 4) 16 se ha utilizado para el análisis de la cutina 7. Hidrogenólisis reduce carbonos funcionalizados a los alcoholes y las estructuras originales deben ser inferida por deuteriolysis con deuteruro de litio y aluminio (LiAlD 4). losdesventaja de este enfoque es el requisito de alta resolución GC / MS para comparar el grado de deuteriation de los polioles grasos obtenidos de hacer las asignaciones de sus estructuras. Transesterificación catalizada por ácido con trifluoruro de boro en metanol (BF 3) se ha utilizado con frecuencia en cutina y suberina depolymerizations 8,17,18, pero el reactivo tiene una vida útil limitada y puede introducir artefactos debido a reacciones secundarias 15. Ácido sulfúrico metanólico también produce ésteres metílicos de los monómeros, pero con una mayor proporción de ácidos grasos 2-hidroxi, que presumiblemente no son verdaderos componentes de poliéster de lípidos, en comparación con otros métodos 10.
El método de transesterificación catalizada por NaOMe descrito en este protocolo produce ésteres metílicos de ácidos grasos que se derivan mediante sililación de grupos hidroxilo, proporcionando espectros de masas característica para la identificación, o por acetilación para proporcionar derivados más estables de grupos hidroxilo for cuantificación. Un inconveniente de esta técnica es que la hidrólisis compite con transesterificación cuando el agua está presente en la reacción. El agua reacciona con NaOMe (el catalizador) y produce NaOH, que a su vez hidroliza ésteres metílicos de ácidos grasos para producir ácidos libres (Figura 2D). Esta es una reacción secundaria indeseable porque dos picos estarán presentes para cada ácido graso: un éster de metilo y un derivado de éster TMSi, lo que complica el análisis. El uso de reactivos anhidros y la adición de acetato de metilo como un co-disolvente para competir con la saponificación son por lo tanto cruciales pasos para evitar la hidrólisis (Figura 2D).
Cutina y suberina contienen entre 1 y 26% de glicerol 4. Sin embargo, este monómero no será detectada por las condiciones experimentales descritas en este protocolo. El glicerol es altamente hidrofílico y, a diferencia de los monómeros de éster metílico de ácidos grasos, será eliminado durante los pasos de lavado de disolventes acuosos. Esta limitación también unaS e aplica a otros métodos de despolimerización cutina, pero glicerol se pueden determinar en la capa acuosa obtenida después de la transesterificación utilizando un método enzimático. Alternativamente, se puede cuantificar utilizando condiciones más suaves (por ejemplo., 0,05 M NaOMe) sin más la extracción de agua para detectar todos los monómeros, incluyendo glicerol 19,20 .Aunque útiles para el propósito de la cuantificación de glicerol, condiciones suaves suelen dar despolimerización incompleta de la cutina y suberina.
Si un GC acoplado a un detector de ionización de llama (FID) está disponible, todas las repeticiones pueden ser analizados en este instrumento con fines cuantitativos, después de los picos de una muestra representativa han sido identificados por GC / MS. Alternativamente, los monómeros en los GC / FID huellas se pueden identificar si se conocen sus índices de retención. El detector de ionización de llama tiene especialmente una alta sensibilidad y una amplia gama de proporcionalidad, que es crítico para la cuantificación de mayores y menores componentes de la muestraen carreras individuales. Además, es robusto y fácil de mantener y operar 15.
El protocolo descrito permite la fiable y reproducible aislamiento, la identificación y la cuantificación de monómeros de poliéster de lípidos de la planta, lo que permite la caracterización química de los mutantes que difieren en la composición de uno o más monómeros de poliéster de lípidos. El procedimiento es escalable, puede ser fácilmente adaptado para procesar tanto pequeñas como cantidades a granel de diversos materiales de plantas, incluyendo semillas, raíces, hojas, tallos y flores. Datos espectrales de masa de monómeros de poliéster de lípidos de muchas especies se han publicado, por ejemplo., 21-26 y constituyen valiosos recursos para identificar monómeros desconocidos al adaptar este protocolo a otros tejidos y / o especies. Este método es aplicable a las investigaciones de la biosíntesis, regulación y distribución de poliésteres de lípidos en las plantas superiores.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |