Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
Piante vascolari si basano su livelli extracellulari che fungono da barriera impermeabile tra tessuti vegetali e l'ambiente esterno. Queste strutture associate parete cellulare lipofilo limitano infezione patogena e regolano il trasporto passivo di gas, acqua e sostanze disciolte in e fuori di tessuti vegetali 1. Tali ostacoli sono la cuticola impianto, una struttura unica per synapomorphic piante 2, e le diverse barriere di diffusione-suberina contenente. La cuticola è uno strato oleophilic sintetizzata dalle cellule epidermiche e legato a loro tramite uno strato pectinaceous sul lato extracellulare della parete cellulare 3-5. Esso racchiude gli organi aerei primarie di piante superiori, funzionando come interfaccia vitale tra tessuti vegetali e l'ambiente.
Cutin, la matrice strutturale della cuticola, e suberina sono due poliesteri glycerolipid insolubili associati con cere solventi estraibili 2,4. Questi polimerico lipids sono composti derivati degli acidi grassi saturi e insaturi e sono strutturalmente e funzionalmente simili. Tuttavia, essi si distinguono per differenze caratteristiche nei siti composizione e deposizione chimica.
Suberina è un poliestere alifatico situato all'interno delle pareti cellulari di alcuni tessuti esterni ed interni formando una parete secondaria. Tessuti Suberized includono periderms di radici, tuberi e corteccia degli alberi, endodermis radice, strati cappotto di semi, e le ferite rimarginate 2. A differenza cutina, poliestere suberina genere contiene alcoli, saturi e acidi dicarbossilici monoinsaturi, e una gran parte di monomeri-molto-lunga catena (C≥20).
Cutin è il più abbondante in poliestere lipidico piante vascolari 6, ed è composta da glicerolo e derivati di acidi grassi C16-C18 interesterificato, come idrossi e idrossi-sostituito epossidiche acidi grassi 4. Mentre la composizione di polimeri cutinavaria tra le specie tracheophyte, i monomeri principali predominanti sono 10, 16-diidrossi 16: 0, 18-idrossi-9,10-epossi 18: 0, e 9,10,18-triidrossi 18: 0 acidi grassi. È interessante notare che, foglie e gambo Arabidopsis cutina è principalmente composto da 18: 2 dicarbossilico 7,8.
Cuticole pianta presente anche una notevole variabilità di spessore, da pochi nanometri a diversi micrometri 9. Poiché isolamento cuticola è un passo laboriosa e che richiede tempo, particolarmente per cuticole foglia molto sottili, come quelli di Arabidopsis thaliana 8, metodi che non utilizzano isolamento cuticola sono stati sviluppati e validati 7,8. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la composizione monomero di cutina in foglie Arabidopsis thaliana da metilato sodico (Naome) depolimerizzazione -catalyzed e gascromatografia successiva / spettrometria di massa (GC / MS) analisi. Questo protocollo offre un metodo affidabile per saggiare il comPosition di poliesteri pianta di lipidi in interi tessuti delipidato, ed è stato adattato da protocolli precedentemente riportati 7,10,11. Campioni di tessuto integrali sono prima omogeneizzati ed esaustivo delipidato, eliminando i lipidi solventi estraibili, tra cui cuticolare e cere epicuticolari, lipidi di membrana, e trigliceridi. Residui arricchita di parete cellulare vengono poi depolimerizzati nei loro costituenti monomeri di esteri metilici da sodio metilato-catalizzata metanolisi. Grassi esteri metilici degli acidi vengono estratti su acidificazione, e derivatizzati per ottenere i loro derivati trimetilsilileteri o acetil corrispondenti. Residui derivatizzati sono altamente volatili, e possono essere eluiti da una colonna gascromatografica ad una temperatura ragionevole senza alterarne la conformazione strutturale durante l'analisi GC / MS.
A differenza di altri biopolimeri come il DNA e le proteine, poliesteri pianta di lipidi non sono fatti da un modello. Invece, le loro composizioni dipendono dalla specificità degli enzimi presenti nei tessuti che rendono questi polimeri extracellulari. Come tale analisi, chimica del componente componenti sono fondamentali per capire composizione di poliestere lipidica.
Metodi chimici di fendere le obbligazioni estere includono saponificazione, idrogenolisi, transmetilazione acido-catalizzata, e la base-catalizzata transmetilazione 2. Ciascuno di essi presenta vantaggi e svantaggi. Saponificazione produce grassi idrossi acidi liberi che possono subire reazioni secondarie. Idrogenolisi con litio alluminio idruro (LiAlH 4) 16 è stato utilizzato per l'analisi cutina 7. Idrogenolisi riduce carboni funzionalizzati per alcoli e delle strutture originali devono essere dedotto da deuteriolysis con deuteruro litio alluminio (LiAlD 4). Ilsvantaggio di questo approccio è il requisito di alta risoluzione GC / MS per confrontare il grado di deuteriation dei polioli grassi ottenuti per fare assegnazioni delle loro strutture. Transesterificazione acido-catalizzata con metanolica trifluoruro di boro (BF 3) è stata spesso utilizzata in cutina e suberina depolymerizations 8,17,18, ma il reagente ha una durata limitata e può introdurre artefatti dovuti a lato reazioni 15. Acido solforico metanolica produce anche esteri metilici dei monomeri, ma con proporzioni maggiori di acidi grassi 2-idrossi, che presumibilmente non sono veri componenti lipidici poliestere, rispetto ad altri metodi 10.
Il metodo transesterificazione catalizzata Naome descritto in questo protocollo produce esteri metilici di acidi grassi che sono derivatizzati da sililazione dei gruppi ossidrilici, fornendo caratteristiche spettri di massa per l'identificazione o per acetilazione di fornire più derivati stabili di gruppi ossidrilici for quantificazione. Uno svantaggio di questa tecnica è che compete con l'idrolisi transesterificazione presenza di acqua nella reazione. Acqua reagisce con Naome (catalizzatore) e produce NaOH, che a sua volta idrolizza grassi esteri metilici acido per produrre acidi liberi (Figura 2D). Questa è una reazione collaterale indesiderabile perché due picchi saranno presenti per ogni acido grasso: un estere metilico e un estere derivato TMSI, complicando così l'analisi. Utilizzando reagenti anidri e aggiungendo acetato di metile come co-solvente di competere con saponificazione sono passaggi così cruciali per prevenire l'idrolisi (Figura 2D).
Cutin e suberina contengono tra l'1 e il 26% glicerolo 4. Tuttavia, questo monomero non viene rilevata dalle condizioni sperimentali descritte in questo protocollo. Il glicerolo è altamente idrofila e, a differenza degli acidi grassi monomeri di estere metilico, sarà eliminato durante le fasi acquose di lavaggio con solvente. Questa limitazione anchepplies ad altri metodi di depolimerizzazione cutina, ma glicerolo possono essere determinati nello strato acquoso ottenuto dopo transesterificazione utilizzando un metodo enzimatico. In alternativa, può essere quantificato utilizzando condizioni più blande (ad es., 0,05 M Naome) senza ulteriore estrazione dell'acqua per rilevare tutti monomeri, compresi glicerolo 19,20 .Anche se utile ai fini della quantificazione glicerolo, condizioni blande solito danno depolimerizzazione incompleta di cutina e suberina.
Se un GC accoppiato ad un rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID) è disponibile, tutte le repliche possono essere analizzati in questo strumento a fini quantitativi, dopo i picchi di un campione rappresentativo sono stati identificati mediante GC / MS. In alternativa, i monomeri in GC / FID tracce possono essere identificati se i loro indici di ritenzione sono noti. Il rivelatore a ionizzazione di fiamma ha particolarmente elevata sensibilità ed una vasta gamma di proporzionalità, che è fondamentale per la quantificazione della maggiori e minori componenti di esempioin corse singole. Inoltre, è robusto e facile da mantenere e far funzionare 15.
Il protocollo descritto consente l'affidabile e riproducibile isolamento, l'identificazione e la quantificazione degli impianti lipidici monomeri poliestere, permettendo la caratterizzazione chimica di mutanti che differiscono nella composizione di uno o più monomeri di poliestere lipidi. La procedura è scalabile, può essere facilmente adattato per elaborare sia piccole e sfusi quantità di vari materiali vegetali, tra radici, semi, foglie, steli e fiori. Dati spettrali di massa di lipidi monomeri poliestere da molte specie sono stati pubblicati ad es., 21-26 e costituiscono risorse preziose per identificare monomeri sconosciuti quando adattare questo protocollo ad altri tessuti e / o specie. Questo metodo è applicabile alle indagini della biosintesi, la regolamentazione e la distribuzione di poliesteri di lipidi nelle piante superiori.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |