Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
Les plantes vasculaires reposent sur des couches extracellulaires qui fonctionnent comme des barrières étanches entre les tissus végétaux et l'environnement externe. Ces structures de parois cellulaires associées à une infection pathogène lipophile limitent et régulent le transport passif de gaz, l'eau et les substances dissoutes dans et hors des tissus végétaux 1. Ces obstacles sont la cuticule de la plante, une structure unique de plantes synapomorphes 2, et les différentes barrières de diffusion contenant subérine. La cuticule est une couche oléophile synthétisé par les cellules épidermiques et lié à eux par l'intermédiaire d'une couche de pectine sur le côté extracellulaire de la paroi cellulaire 5.3. Il enveloppe les organes aériens primaires de plantes supérieures, fonctionnant comme une interface vitale entre les tissus végétaux et l'environnement.
Cutin, la matrice de structure de la cuticule, et subérine sont deux polyesters glycérolipides insolubles associés avec des cires solvant extractibles 2,4. Ces l polymèreipids sont constitués de dérivés saturés et insaturés et d'acides gras sont à la fois structurellement et fonctionnellement similaire. Toutefois, elles se distinguent par des différences dans les caractéristiques de composition et de dépôt des sites chimiques.
Subérine est un polyester aliphatique situé à l'intérieur des parois cellulaires de certains tissus externes et internes formant une paroi secondaire. Tissus subérisées comprennent péridermes de racines, de tubercules et de l'écorce d'arbre, endoderme profondes, couches de revêtement de semences, et les plaies guéries 2. Contrairement à la cutine, la subérine de polyester contient typiquement des alcools, des acides dicarboxyliques saturés et mono-insaturés, et une grande proportion de monomères à très longue chaîne (C≥20).
Cutin polyester lipidique est le plus abondant dans les plantes vasculaires 6, et est composé de glycérol et en C16-C18 dérivés d'acides gras interestérifié, tels que les acides gras hydroxy et hydroxy-4 époxy substitué. Bien que la composition de polymères cutinevarie selon les espèces de tracheophyte, les monomères principaux sont plus prédominants 10, 16-dihydroxy 16: 0, 18-hydroxy-9,10-époxy 18: 0, et 9,10,18-trihydroxy 18: 0 des acides gras. Fait intéressant, la feuille et la tige Arabidopsis cutine est composé principalement de 18: 2 acide dicarboxylique 7,8.
Cuticules végétales présentent aussi une grande variabilité dans l'épaisseur, allant de quelques nanomètres à plusieurs micromètres 9. Depuis l'isolement de la cuticule est une étape laborieuse et prend du temps, en particulier pour les très minces cuticules des feuilles tels que ceux d'Arabidopsis thaliana 8, méthodes qui contournent l'isolement de la cuticule ont été développés et validés 7,8. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour étudier la composition de monomères de cutine dans des feuilles d'Arabidopsis thaliana par le méthoxyde de sodium (NaOMe) et dépolymérisation catalysée par chromatographie en phase gazeuse subséquente / spectrométrie de masse (CG / SM) d'analyse. Ce protocole offre une méthode robuste pour le dosage de la composition de polyesters de lipides dans les tissus de la plante délipidés entiers, et a été adapté à partir de protocoles précédemment rapportés 7,10,11. Des échantillons de tissus entiers sont d'abord homogénéisé et exhaustive délipidé, enlever les lipides solvant extractible y compris la cuticule et les cires épicuticulaires, lipides membranaires, et triglycérides. Des résidus de parois cellulaires sont enrichis ensuite dépolymérisés en leurs monomères constitutifs ester méthylique par du méthylate de sodium méthanolyse catalysée. Gras esters méthyliques d'acide sont extraites lors de l'acidification et dérivés pour obtenir leurs dérivés triméthylsilyle ou acétyle correspondantes. Résidus dérivés sont très volatiles et peuvent être éluées d'une colonne de chromatographie en phase gazeuse à une température raisonnable sans modification de leur conformation structurelle lors de l'analyse GC / MS.
Contrairement à d'autres biopolymères tels que les protéines et l'ADN, des polyesters de lipides des plantes ne sont pas fabriquées à partir d'un modèle. Au lieu de cela, leurs compositions dépendent de la spécificité des enzymes présentes dans les tissus qui font de ces polymères extracellulaires. Comme de telles analyses, chimiques du constituant composants sont essentiels pour comprendre la composition de polyester lipidique.
Les méthodes chimiques pour couper des liaisons ester comprennent saponification, l'hydrogénolyse, transmethylation catalyse acide, et catalysée par une base transmethylation 2. Chacun d'eux a ses avantages et ses inconvénients. Saponification produit des acides gras hydroxyles libres qui peuvent subir des réactions secondaires. L'hydrogénolyse avec de l'hydrure de lithium-aluminium (LiAlH 4) 16 a été utilisé pour l'analyse de la cutine 7. Hydrogénolyse réduit carbones fonctionnalisés d'alcools et les structures originales doivent être inférée par deuteriolysis de lithium-aluminium deutérure (LiAlD 4). Lainconvénient de cette approche est l'exigence de haute résolution GC / MS de comparer le degré de deuteriation des polyols gras obtenus à effectuer des affectations de leurs structures. Transestérification à catalyse acide avec méthanolique de trifluorure de bore (BF3) a été fréquemment utilisé dans la cutine et subérine dépolymérisations 8,17,18, mais le réactif a une durée de vie limitée et peut introduire des artefacts dus à des réactions secondaires 15. L'acide sulfurique méthanolique donne aussi des esters méthyliques des monomères mais avec de plus grandes proportions d'acides gras 2-hydroxy, qui sont probablement pas de vrais composants de polyester de lipides, par rapport à 10 d'autres méthodes.
Le procédé de transestérification NaOMe catalysée décrit dans le présent protocole produit des esters méthyliques d'acides gras qui sont transformés en dérivés par silylation des groupes hydroxyle, en fournissant les spectres de masse caractéristique d'identification, ou par acétylation pour donner des dérivés plus stables de groupes hydroxyle for quantification. Un inconvénient de cette technique est que l'hydrolyse est en concurrence avec la transestérification en présence d'eau dans la réaction. L'eau réagit avec NaOMe (le catalyseur) et de NaOH produit, qui à son tour hydrolyse des esters gras méthyliques d'acide pour donner les acides libres (Figure 2D). Ceci est une réaction secondaire indésirable parce que deux pics sont présents pour chaque acide gras: un ester de méthyle et d'un dérivé d'ester TMSi, ce qui complique l'analyse. En utilisant des réactifs anhydres et en ajoutant de l'acétate de méthyle comme co-solvant de rivaliser avec saponification sont des étapes cruciales pour empêcher ainsi l'hydrolyse (figure 2D).
Cutine et subérine contiennent entre 1 et 26% de glycerol 4. Toutefois, ce monomère ne sera pas détecté par les conditions expérimentales décrites dans ce protocole. Le glycérol est hautement hydrophile et, à la différence des monomères d'ester de méthyle d'acide gras, seront éliminées au cours des étapes solvant aqueux de lavage. Cette limitation a égalementpplies à d'autres méthodes de dépolymérisation cutine, mais glycerol peuvent être déterminées dans la couche aqueuse obtenue après la transestérification en utilisant une méthode enzymatique. En variante, il peut être quantifiée en utilisant des conditions plus douces (par exemple., 0,05 M de NaOMe) sans autre extraction à l'eau afin de détecter tous les monomères, y compris le glycérol 19,20 .Bien utile à des fins de quantification glycérol, des conditions douces donnent généralement dépolymérisation incomplète de la cutine et subérine.
Si un GC couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID) est disponible, toutes les répétitions peuvent être analysés dans cet instrument à des fins quantitatives, après les pics d'un échantillon représentatif ont été identifiés par GC / MS. Alternativement, les monomères dans les GC / FID traces peuvent être identifiés si leurs indices de rétention sont connus. Le détecteur à ionisation de flamme a surtout une sensibilité élevée et une large gamme de proportionnalité, ce qui est essentiel pour la quantification des majeurs et mineurs composants de l'échantillondans les courses individuelles. En outre, il est robuste et facile à entretenir et exploiter 15.
Le protocole décrit permet l'isolement fiable et reproductible, l'identification et la quantification des lipides des plantes monomères de polyester, ce qui permet la caractérisation chimique des mutants qui diffèrent par la composition d'un ou plusieurs monomères de polyester lipidiques. La procédure est évolutif, il peut être facilement adapté pour traiter à la fois les petites et les grosses quantités de diverses matières végétales, y compris les racines, graines, feuilles, tiges et fleurs. Données spectrales de masse de lipides polyester monomères de nombreuses espèces ont été publiés par ex., 21-26 et constituent des ressources précieuses pour identifier les monomères inconnus lors de l'adaptation de ce protocole à d'autres tissus et / ou espèces. Cette méthode est applicable aux enquêtes de la biosynthèse, la réglementation, et la distribution de polyesters lipidiques chez les plantes supérieures.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |