Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
維管束植物は、植物組織と外部環境との間の防水障壁として機能する細胞外の層に依存しています。これらの親油性の細胞壁に関連する構造は、病原体感染を制限し、および植物組織1からのガス、水および溶解した物質の受動輸送を調節します。このような障壁は、植物のクチクラ、植物2、および異なるスベリン含有拡散バリアに固有synapomorphic構造です。キューティクルは、細胞壁3-5の細胞外側にペクチンの層を介して上皮細胞により合成され、それらに結合した親油性層です。これは、植物組織と環境との間の重要なインターフェースとして機能し、高等植物の主要な空中臓器を包みます。
クチン、キューティクルの構造マトリックス、およびスベリンは、溶媒抽出ワックス2,4に関連する2つの不溶性グリセロポリエステルです。これらの高分子リットルipidsは、飽和および不飽和脂肪酸誘導体で構成され、両方の構造的および機能的に類似しているされています。しかし、彼らは化学組成と堆積サイトでの特性差によって区別されています。
スベリンは、二次壁を形成する特定の外部と内部組織の細胞壁の内側に位置する脂肪族ポリエステルです。 Suberized組織が 根、塊茎および樹皮のperiderms、根の内皮、種 皮層、および癒さ傷2を含みます 。クチンとは異なり、スベリンポリエステルは、一般的に、アルコール、飽和およびモノ不飽和ジカルボン酸、および超長鎖モノマー(C≥20)の大部分が含まれています。
クチンは、維管束植物6で最も豊富な脂質ポリエステルであり、グリセロールおよび、ヒドロキシおよびヒドロキシ置換されたエポキシ脂肪酸4としてC16-C18 interesterified脂肪酸誘導体、から構成されています。クチンポリマーの組成をしながら0、18 – ヒドロキシ-9,10-エポキシ18:0、および9,10,18トリヒドロキシ18:0脂肪酸維管束植物種間で異なり、最も優勢な主要なモノマーは、10、16ジヒドロキシ16です。 2ジカルボン酸7,8:興味深いことに、シロイヌナズナの葉とクチン茎は主に18から構成されています。
植物のキューティクルも数ナノメートルから数マイクロメートル9までの範囲、厚さにかなりのばらつきを示します。キューティクル分離は特に、 シロイヌナズナ 8のものと非常に薄い葉のクチクラのための労力と時間のかかるステップであるため、キューティクルの分離を回避する方法が開発され、7,8を検証されています。ここでは、ナトリウムメトキシド(NaOMeの)触媒解重合とそれに続くガスクロマトグラフィー/質量分析(GC / MS)分析によりシロイヌナズナの葉におけるクチンのモノマー組成物を研究するための詳細なプロトコルを記述する。このプロトコルは、共同をアッセイするための堅牢な方法を提供しています全体脱脂組織における植物脂質ポリエステルのmposition、とは、以前に報告されたプロトコル7,10,11から適応されています。全組織サンプルは、クチクラとエピクチクラワックス、膜脂質、およびトリアシルグリセロールを含む溶剤抽出脂質を除去し、均質化された第一及び徹底的に脱脂されています。細胞壁に富む残渣を、次いでナトリウムメトキシドで触媒メタノリシスによってそれらの構成メチルエステルモノマーに解重合されます。脂肪酸メチルエステルは、酸性化時に抽出され、それらの対応するトリメチルシリルまたはアセチル誘導体を得るために誘導体化されます。誘導体化された残基は、高度に揮発性であり、およびGC / MS分析の間にその構造コンフォメーションを変更することなく、妥当な温度でのガスクロマトグラフィーカラムから溶出することができます。
DNAやタンパク質などの生体高分子、他のとは異なり、植物脂質のポリエステルは、テンプレートから作られていません。代わりに、その組成物は、これらの細胞外ポリマーを製造するための組織に存在する酵素の特異性に依存します。このように、構成成分の化学分析は、脂質のポリエステル組成物を理解することが重要です。
エステル結合を切断するための化学的方法は、ケン化、水素化分解、酸触媒トランスメチレーション、および塩基触媒トランスメチレーション2を含みます 。それらの各々は、長所と短所を有しています。鹸化は、二次反応を受けることができる遊離脂肪酸ヒドロキシ酸を生成します。水素化アルミニウムリチウム(LiAlH 4を)と水素化分解16は、クチン解析7に使用されています。水素化分解は、アルコールに官能基化炭素を減少させ、元の構造は、重水素化リチウムアルミニウム(LiAlD 4)でdeuteriolysisによって推論される必要があります。ザ・このアプローチの欠点は、それらの構造の割り当てを行うために得られる脂肪ポリオールのdeuteriationの程度を比較するための高分解能GC / MSの要件です。メタノール三フッ化ホウ素(BF 3)との酸触媒エステル交換を頻繁にクチンおよびスベリン8,17,18解重合に使用されてきたが、試薬は、限定された貯蔵寿命を有し、そして反応を15側に起因するアーチファクトを導入することができます。メタノール硫酸また、モノマーのメチルエステルが得られるが、おそらく、他の方法10に比べ、真の脂質ポリエステル成分でない2-ヒドロキシ脂肪酸のより大きな割合を有します。
このプロトコールに記載のNaOMe触媒によるエステル交換法は、識別のための特徴的な質量スペクトルを提供し、ヒドロキシル基のシリル化によって誘導体化された脂肪酸メチルエステルを生成し、またはアセチル化によってfoのヒドロキシル基のより安定な誘導体を提供することR定量。この技術の一つの欠点は、水が反応中に存在する場合、加水分解は、エステル交換反応と競合することです。水は、のNaOMe(触媒)と反応し、次いで、遊離酸( 図2D)を得た脂肪酸メチルエステルを加水分解水酸化ナトリウムを生成します。したがって、分析を複雑に、メチルエステルおよびTMSIエステル誘導体:2つのピークが、各脂肪酸のために存在するので、これは望ましくない副反応です。無水の試薬 を使用し、ケン化に対抗するために共溶媒として酢酸メチルを添加することは、加水分解( 図2D)を防止することが重要なステップです。
クチンおよびスベリンは1と26%グリセロール4との間に含まれています。しかしながら、このモノマーは、このプロトコルに記載された実験条件では検出されないであろう。グリセロールは、脂肪酸メチルエステルモノマーとは異なり、水性溶媒洗浄工程中に除去される、高度に親水性であり、。この制限は、クチン他の解重合方法にpplies、グリセロール、酵素法を用いてエステル交換した後、得られた水層に決定することができます。あるいは、グリセロール定量化の目的のために有用な.Althoughグリセロール19,20を含む全てのモノマーを検出するためにさらに水抽出することなく、より穏やかな条件( 例えば 、0.05 MのNaOMe)を用いて定量することができ、穏やかな条件は、通常、クチンの不完全な解重合を与えますスベリン。
炎イオン化検出器(FID)に結合されたGCが利用可能である場合の代表的な試料のピークは、GC / MSによって同定された後、すべての複製は、定量的な目的のために、この機器で分析することができます。それらの保持指標が知られている場合は別の方法として、GC / FIDトレース中のモノマーを特定することができます。水素炎イオン化検出器は、特に高感度、メジャーとマイナーの試料成分の定量化のために重要である比例の広い範囲を持っていますシングルランインチまた、堅牢で維持し、15を操作しやすいです。
記載されたプロトコルは、一つ以上の脂質ポリエステルモノマーの組成が異なる変異体の化学的な特徴付けを可能にする、植物脂質のポリエステルモノマーの信頼性と再現性の分離、同定、および定量を可能にします。手続きは、それが容易に根、種子、葉、茎、花などの種々の植物材料の小さなバルクの両方の量を処理するように適合させることができる、拡張可能です。多くの種からの脂質ポリエステルモノマーの質量スペクトルデータは、 例えば公開されている。、21-26と他の組織および/ または種にこのプロトコルを適応させる際に、未知の単量体を識別するために貴重なリソースを構成しています。この方法は、高等植物における脂質ポリエステルの生合成、調節、及び分布の調査に適用可能です。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
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PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |