Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
Vaatplanten afhankelijk extracellulaire lagen die als waterdichte barrières tussen plantenweefsels en de externe omgeving. Deze lipofiele celwand geassocieerde structuren beperken pathogene infectie en regelen het passieve transport van gassen, water en opgeloste stoffen in en uit plantenweefsels 1. Dergelijke barrières zijn de plant cuticula, een synapomorphic structuur unieke planten 2, en anders-suberine bevatten diffusiebarrières. De cuticula is een oleofiele laag gesynthetiseerd door epidermale cellen en bonden ze via een pectinaceous laag op de extracellulaire zijde van de celwand 3-5. Het omhult de primaire antenne organen van hogere planten, functioneren als een essentiële interface tussen plantenweefsels en milieu.
Cutine, de structurele matrix van de cuticula en suberine zijn twee onoplosbaar glycerolipide polyesters geassocieerd met oplosmiddel-uittrekbare wassen 2,4. Deze polymere lipids bestaan uit verzadigde en onverzadigde vetzuurderivaten en zowel structureel en functioneel vergelijkbaar. Ze zijn echter onderscheiden door karakteristieke verschillen in chemische samenstelling en depositie sites.
Suberine een alifatische polyester zich in de celwanden van bepaalde externe en interne weefsels vormen van een secundaire wand. Suberized weefsels onder periderms van wortels, knollen en boomschors, wortel endodermis, zaadhuid lagen, en genezen wonden 2. Anders cutine, de suberin polyester bevat typisch alcoholen, verzadigde en mono-onverzadigde dicarbonzuren, en een groot deel van zeer lange keten monomeren (C≥20).
Cutin is het meest voorkomende lipide polyester vaatplanten 6 en bestaat uit glycerol en C16-C18 vetzuur veresterde derivaten, zoals hydroxy en hydroxy-gesubstitueerde epoxy-vetzuren 4. Hoewel de samenstelling van polymeren cutinvarieert in tracheophyte species, de meest overheersende primaire monomeren 10, 16-dihydroxy-16: 0, 18-hydroxy-9,10-epoxy 18: 0 en 9,10,18-tri- 18: 0-vetzuren. Interessant Arabidopsis blad en stengel cutin bestaat hoofdzakelijk uit 18: 2 dicarbonzuur 7,8.
Plant opperhuid vormen ook een aanzienlijke variabiliteit in dikte variërend van enkele nanometers tot enkele micrometers 9. Aangezien cuticula isolatie is een moeizame en tijdrovende stap, met name voor zeer dunne leaf cuticles zoals die van Arabidopsis thaliana 8 zijn werkwijzen die cuticula isolatie omzeilen ontwikkeld en gevalideerd 7,8. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de monomeersamenstelling van cutin in Arabidopsis thaliana bladeren van natriummethoxide (NaOMe) gekatalyseerde depolymerisatie en daaropvolgende gaschromatografie / massaspectrometrie (GC / MS) analyse bestuderen. Dit protocol biedt een robuuste methode voor het bepalen van de composition van plantaardige lipiden polyesters geheel ontvette weefsels, en is aangepast van eerder gerapporteerde protocollen 7,10,11. Hele weefselmonsters zijn eerste gehomogeniseerd en uitputtend gedelipideerd, het verwijderen van solvent-extraheerbare lipiden waaronder cuticulair en epicuticular wassen, membraanlipiden, en triacylglycerolen. Celwand verrijkte resten worden vervolgens gedepolymeriseerd in hun samenstellende methylester monomeren van natrium methoxide-gekatalyseerde methanolyse. Fatty acid methyl esters worden geëxtraheerd na aanzuren, en gederivatiseerd hun overeenkomstige trimethylsilyl of acetyl derivaten te verkrijgen. Gederivatiseerde residuen zijn zeer volatiel en kan worden geëlueerd van een gaschromatografiekolom bij een redelijke temperatuur zonder dat de structurele conformatie in GC / MS-analyse.
In tegenstelling tot andere biopolymeren zoals DNA en proteïnen, worden plantaardige lipiden polyesters niet via een template. In plaats daarvan, de samenstellingen afhankelijk van de specificiteit van de in de weefsels die deze extracellulaire polymeren maken enzymen. Als zodanig, chemische analyses van de samenstellende componenten essentieel lipide polyestersamenstelling begrijpen.
Chemische werkwijzen voor splitsen esterbindingen bevatten verzepen, hydrogenolyse, zuur-gekatalyseerde transmethylering en base-gekatalyseerde transmethylering 2. Elk van hen heeft voordelen en nadelen. Verzeping produceert vrije vetzuren hydroxy zuren die secundaire reacties kunnen ondergaan. Hydrogenolyse met lithiumaluminiumhydride (LiAlH4) 16 werd gebruikt voor analyse cutine 7. Hydrogenolyse vermindert gefunctionaliseerde koolstoffen alcoholen en de oorspronkelijke structuren moeten worden afgeleid door deuteriolysis met lithium aluminium deuteride (LiAlD 4). Denadeel van deze benadering is dat hoge resolutie GC / MS om de mate van deuteriation van de vetzuren polyolen verkregen opdrachten hun structuren te vergelijken. Zuur gekatalyseerde omestering met methanol boortrifluoride (BF3) is veelvuldig bij cutin en suberine depolymerizations 8,17,18, maar het reagens beperkt houdbaar en kunnen artefacten vanwege reacties 15 kant voeren. Methanol zwavelzuur levert ook methylesters van de monomeren, maar met grotere hoeveelheden van 2-hydroxy vetzuren, die vermoedelijk geen echte lipide polyester componenten, in vergelijking met andere methoden 10.
De NaOMe-gekatalyseerde omestering werkwijze beschreven in dit protocol produceert vetzuurmethylesters die zijn gederivatiseerd door silylering van hydroxylgroepen, die kenmerkend massaspectra voor identificatie of door acetylering meer stabiele derivaten van hydroxylgroepen verschaffen for kwantificering. Een nadeel van deze techniek is dat hydrolyse concurreert met transesterificatie wanneer water aanwezig in de reactie. Water reageert met NaOMe (de katalysator) en produceert NaOH, die op zijn beurt hydrolyseert vetzuurmethylesters aan vrije vetzuren (figuur 2D) werd verkregen. Dit is een ongewenste nevenreactie omdat twee pieken voor elk vetzuur aanwezig zijn: methyl ester en een TMSi esterderivaat, waardoor de analyse bemoeilijkt. Met behulp van watervrije reagentia en het toevoegen methylacetaat als een co-oplosmiddel om te concurreren met verzeping dus cruciaal stappen hydrolyse (figuur 2D) te voorkomen.
Cutine en suberine bevatten tussen 1 en 26% glycerol 4. Dit zal echter monomeer niet worden gedetecteerd door de in dit protocol beschreven experimentele omstandigheden. Glycerol is sterk hydrofiel en, anders dan vetzure methylester monomeren wordt in het waterige oplosmiddel stappen wassen worden verwijderd. Deze beperking ookpplies andere cutin depolymerisatie werkwijzen, maar glycerol kan worden bepaald in de waterige laag verkregen na omestering onder toepassing van een enzymatische methode. Alternatief kan gekwantificeerd worden met mildere omstandigheden (bijv., 0,05 M NaOMe) zonder verdere extractie met water om alle sporen monomeren, zoals glycerol 19,20 .Hoewel bruikbaar voor het doel van glycerol kwantificering milde omstandigheden geven meestal onvolledige depolymerisatie van cutin en suberine.
Als een GC gekoppeld met een vlamionisatiedetector (FID) beschikbaar is, kunnen alle replicaten worden geanalyseerd instrument voor kwantitatieve doeleinden, na toppen van een representatief monster zijn geïdentificeerd met GC / MS. Als alternatief kunnen monomeren in het GC / FID sporen worden geïdentificeerd als hun retentie indices zijn bekend. De vlamionisatiedetector heeft bijzonder hoge gevoeligheid en een breed scala van evenredigheid wat essentieel voor het kwantificeren van grote en kleine monsterbestanddelenin enkele runs. Bovendien is robuust en gemakkelijk te onderhouden en te bedienen 15.
De beschreven protocol zorgt voor een betrouwbare en reproduceerbare isolatie, identificatie en kwantificatie van plantaardige lipiden polyester monomeren, waardoor de chemische karakterisering van mutanten die verschillen in de samenstelling van één of meer lipide polyester monomeren. De procedure is schaalbaar, kan gemakkelijk worden aangepast voor zowel kleine als grote hoeveelheden van verschillende plantaardige materialen, zoals wortels, zaden, bladeren, stengels en bloemen verwerken. Massaspectrumgegevens van lipide polyester monomeren van vele soorten zijn bijvoorbeeld gepubliceerd., 21-26 en vormen waardevolle middelen om onbekende monomeren te identificeren bij de aanpassing van dit protocol om andere weefsels en / of soorten. Deze methode is van toepassing op het onderzoek van de biosynthese, regelgeving, en de verdeling van lipiden polyesters in hogere planten.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |