Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
As plantas vasculares confiar em camadas extracelulares, que funcionam como barreiras impermeáveis entre os tecidos de plantas e o ambiente externo. Estas estruturas associadas da parede celular lipofílico restringir a infecção patogénica e regular o transporte passivo de gases, água e substâncias dissolvidas dentro e para fora dos tecidos da planta 1. Tais barreiras são a cutícula da planta, uma estrutura única para plantas sinapomórficas 2, e barreiras de difusão diferentes contendo suberina. A cutícula é uma camada oleof�lico sintetizado por células epidérmicas e ligado a eles por meio de uma camada péctico no lado extracelular da parede celular 3-5. É encerra os órgãos aéreos primárias de plantas superiores, funcionando como uma interface vital entre tecidos da planta e do meio ambiente.
Cutina, a matriz estrutural da cutícula, e suberina são dois poliésteres glicerolípido insolúveis associadas com ceras solvente 2,4-extraíveis. Estes l poliméricoIPIDs são compostas de derivados de ácidos gordos saturados e insaturados e de ambos são estruturalmente e funcionalmente semelhante. No entanto, eles são distinguíveis por diferentes características de sites de composição e deposição química.
Suberina é um poliéster alifático localizado no interior das paredes das células de certos tecidos internos e externos que formam uma parede secundária. Tecidos suberizadas incluem periderms de raízes, tubérculos e casca de árvore, endoderme raiz, camadas de revestimento de sementes, e feridas curadas 2. Ao contrário cutina, o poliéster suberina tipicamente contém álcoois, ácidos dicarboxílicos saturados e mono-insaturados, e uma grande proporção de monómeros de cadeia muito longa (C≥20).
Cutina é o mais abundante poliéster lípido em plantas vasculares 6, e é composto de glicerol e C16-C18 derivados de ácidos gordos interesterificada, tais como ácidos gordos hidroxi e hidroxi-4 epóxi substituído. Embora a composição de polímeros cutinavaria entre espécies tracheophyte, os monómeros primários mais predominantes são de 10, 16-di-hidroxi 16: 0, 18-hidroxi-9,10-epoxi-18: 0, e 9,10,18-tri-hidroxi-18: 0 ácidos gordos. Curiosamente, folha de Arabidopsis e cutina haste é composta principalmente de 18: 2 de ácido dicarboxílico 7,8.
Cutículas vegetais também apresentam uma considerável variabilidade em espessura, variando de poucos nanómetros a vários micrómetros 9. Uma vez que o isolamento cutícula é uma etapa trabalhosa e demorada, especialmente para cutículas folha muito fina, tais como aqueles da Arabidopsis thaliana 8, os métodos que não utilizam o isolamento cutícula foram desenvolvidos e validados 7,8. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para o estudo da composição de monómero de cutina em folhas de Arabidopsis thaliana por metóxido de sódio (NaOMe) catalisada por despolimerização e subsequente cromatografia em fase gasosa / espectrometria de massa (GC / MS) análise. Este protocolo oferece um método robusto para ensaiar a composition de poliésteres planta de lipídios nos tecidos delipidadas inteiros, e foi adaptado a partir de protocolos previamente relatados 7,10,11. Amostras de tecido integrais são primeiro homogeneizado e exaustivamente delipidadas, removendo lipídios solventes extraível incluindo cuticular e ceras epicuticulares, lípidos da membrana, e triacilgliceróis. Enriquecida resíduos de parede celular são então despolimerizados em seus constituintes monómeros de éster de metilo por metanólise catalisada por metóxido de sódio. Ésteres metílicos dos ácidos gordos são extraídos por acidificação, e os seus derivados para obter trimetilsililo ou acetilo derivados correspondentes. Resíduos derivatizados são altamente voláteis, e podem ser eluídas a partir de uma coluna de cromatografia em fase gasosa a uma temperatura razoável, sem alterar a sua conformação estrutural durante a análise de GC / MS.
Ao contrário de outros biopolímeros, tais como proteínas e ADN, poliésteres planta de lípidos não são feitas a partir de um molde. Em vez disso, as composições dependem da especificidade das enzimas presentes nos tecidos que formam estes polímeros extracelulares. Como tais análises, química do componente de componentes são essenciais para compreender a composição de poliéster de lípidos.
Os métodos químicos para clivar ligações éster incluem saponificação, hidrogenólise, transmetilação catalisada por ácido, e catalisada por base transmetilação 2. Cada um deles tem vantagens e desvantagens. Saponificação produz ácidos gordos hidroxi livres que podem sofrer reações secundárias. A hidrogenólise com hidreto de alumínio e lítio (LiAlH4) 16 foi utilizado para a análise cutina 7. A hidrogenólise reduz carbonos funcionalizados para álcoois e as estruturas originais precisam de ser inferida por deuteriolysis com deutereto de alumínio e lítio (LiAlD 4). odesvantagem desta abordagem é a exigência de alta resolução GC / MS para comparar o grau de deuteriation dos polióis gordos obtidos para fazer atribuições das suas estruturas. Transesterificação catalisada por ácido com metanol trifluoreto de boro (BF3) tem sido freqüentemente utilizada em cutina e suberina depolymerizations 8,17,18, mas o reagente tem uma vida útil limitada e pode introduzir artefactos devido a reacções secundárias 15. Ácido sulfúrico metanólico também produz ésteres metílicos dos monómeros mas com maiores proporções de ácidos gordos de 2-hidroxi, que presumivelmente não são verdadeiros componentes de poliéster lípido, em comparação com outros métodos 10.
O método de transesterificação catalisada NaOMe descrito neste protocolo produz ésteres metílicos de ácidos gordos que são derivatizados por sililação de grupos hidroxilo, fornecendo espectros de massa característico para a identificação, ou por acetilação para proporcionar derivados mais estáveis de grupos hidroxilo foR quantificação. Uma desvantagem desta técnica é que a hidrólise compete com a transesterif icação, quando a água está presente na reacção. A água reage com NaOMe (o catalisador) e produz NaOH, que por sua vez hidrolisa ésteres metílicos de ácidos gordos para se obter os ácidos livres (Figura 2D). Esta é uma reacção colateral indesejável porque dois picos irá estar presente para cada ácido gordo: um éster de metilo e um derivado de éster TMSi, complicando assim a análise. Usando reagentes anidros e a adição de acetato de metilo como um co-solvente para competir com saponificação são assim passos cruciais para prevenir a hidrólise (Figura 2D).
Cutin e suberina conter entre 1 e 26% de glicerol 4. No entanto, este monómero não será detectado por as condições experimentais descritas neste protocolo. O glicerol é altamente hidrofílico e, ao contrário dos monómeros de éster de metilo de ácidos gordos, será eliminada durante os passos de solvente de lavagem aquosas. Esta limitação também umpplies a outros métodos de despolimerização cutina, glicerol, mas pode ser determinada na camada aquosa obtida após transesterificação utilizando um método enzimático. Alternativamente, ele pode ser quantificada usando condições mais suaves (por exemplo., 0,05 M NaOMe) sem nova extracção da água para detectar todos os monómeros, incluindo glicerol 19,20 .Embora útil para a finalidade de quantificação glicerol, condições suaves geralmente dar incompleto de despolimerização e cutina suberina.
Se um GC acoplado a um detector de ionização de chama (FID) está disponível, todas as repetições podem ser analisados no presente instrumento, para fins quantitativos, depois de picos de uma amostra representativa foram identificados por GC / MS. Como alternativa, os monômeros em GC / FID traços podem ser identificados, se os seus índices de retenção são conhecidos. O detector de ionização de chama tem especialmente elevada sensibilidade e uma ampla gama de proporcionalidade, que é crítica para a quantificação de componentes principais e secundárias amostrasem corridas individuais. Além disso, é robusto e fácil de manter e operar 15.
O protocolo descrito permite a fiável e reprodutível isolamento, identificação e quantificação dos monómeros de poliéster de lípidos de plantas, permitindo a caracterização de mutantes química que diferem na composição de um ou mais monómeros de poliéster de lípidos. O procedimento é expansível, ele pode ser facilmente adaptada para processar tanto pequenas quantidades a granel e de diversos materiais de planta, incluindo sementes, raízes, folhas, caules e flores. Dados de espectrometria de massa de monómeros de poliéster de lipídios de muitas espécies têm sido publicados por ex., 21-26 e constituem recursos valiosos para identificar monómeros desconhecidos quando adaptar este protocolo para outros tecidos e / ou espécies. Este método é aplicável para a biossíntese de investigações, regulação e de distribuição de poliésteres de lípidos em plantas superiores.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |