Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
צמחים עילאיים להסתמך על שכבות תאיים המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות צמח והסביבה החיצונית. המבנים הקשורים קיר תא lipophilic אלה מגבילים את הזיהום פתוגניים ולהסדיר את התחבורה הפסיבית של גזים, מים, וחומרים מומסים ובמתוך רקמות צמח 1. מחסומים כאלה הם ציפורן הצמח, מבנה synapomorphic ייחודי לצמחים 2, ומחסומי דיפוזיה המכיל שַׁעֲמָן שונים. הציפורן היא שכבת oleophilic המסונתזת על ידי תאי האפידרמיס וחייבת אותם באמצעות שכבת pectinaceous בצד תאי של דופן התא 3-5. זה סוגר את האיברים אוויריים העיקריים של צמחים גבוהים יותר, המתפקד כממשק חיוני בין רקמות צמח והסביבה.
Cutin, המטריצה המבנית של הציפורן, ושַׁעֲמָן שני פוליאסטר glycerolipid מסיס הקשורים שעוות ממס נשלף 2,4. l פולימרים אלהipids מורכב של נגזרי חומצת שומן רוויים ובלתי רוויים והם גם מבני ותפקודי דומים. עם זאת, הם נבדלים על ידי הבדלים אופייניים באתרי הרכב ותצהיר כימיים.
שַׁעֲמָן הוא פוליאסטר אליפטי הממוקם בתוך קירות התא של רקמות פנימיות וחיצוניות מסוימות ויוצרות קיר המשני. רקמות Suberized כוללות periderms של שורשים, פקעות וקליפת עץ, endodermis שורש, שכבות מעיל זרע, ופצעים הגלידו 2. שלא כמו cutin, פוליאסטר שַׁעֲמָן בדרך כלל מכיל אלכוהול, רווי וחומצות dicarboxylic מונו-בלתי רווי, וחלק גדול ממונומרים מאוד ארוכת-שרשרת (C≥20).
Cutin הוא פוליאסטר שומנים הנפוץ ביותר בצמחים עילאיים 6, והוא מורכב מגליצרול ונגזרי חומצת שומן interesterified C16-C18, כגון חומצות שומן-אפוקסי הידרוקסי הידרוקסי והוחלף 4. בעוד ההרכב של פולימרים cutinמשתנה בין מיני tracheophyte, מונומרים העיקריים השולט ביותר הם 10, 16-dihydroxy 16: 0,-9,10-אפוקסי 18-הידרוקסי 18: 0, ו9,10,18-trihydroxy 18: 0 חומצות שומן. מעניין לציין, עלה ארבידופסיס ונובע cutin מורכב בעיקר של 18: 2 חומצת dicarboxylic 7,8.
שורש צמח גם להציג שונות ניכר בעובי, החל כמה ננומטרים לכמה מיקרומטרים 9. מאז בידוד ציפורן הוא צעד מייגע וגוזל זמן, במיוחד לעור קרני עלה דק מאוד כמו אלה של thaliana ארבידופסיס 8, שיטות העוקפות בידוד ציפורן פותחו ומאומתים 7,8. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט ללמוד הקומפוזיציה מונומר של cutin בעלי thaliana ארבידופסיס ידי methoxide נתרן (NaOMe) depolymerization -catalyzed וגז כרומטוגרפיה הבאה / ספקטרומטר מסה (GC / MS) ניתוח. פרוטוקול זה מציע שיטה חזקה למנסה לאמוד את שיתוףmposition של פוליאסטר שומנים צמח ברקמות delipidated כל, והותאם מפרוטוקולים שדווחו בעבר 7,10,11. דגימות רקמה שלמות הן ראשון הומוגני וממצה delipidated, הסרת שומני ממס לחילוץ כולל cuticular ושעוות epicuticular, שומני קרום, וtriacylglycerols. אז שאריות מועשרות קיר תא depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידי methanolysis-זרז methoxide נתרן. אסטרים מתיל חומצת שומן מופקים על החמצה, וderivatized להשיג נגזרי trimethylsilyl או אצטיל המקביל שלהם. שאריות derivatized תנודתיות מאוד, ויכולות להיות eluted מעמודת גז כרומטוגרפיה בטמפרטורה סבירה מבלי לשנות קונפורמציה המבנית שלהם במהלך ניתוח GC / MS.
שלא כמו biopolymers האחר כגון דנ"א וחלבונים, השומנים פוליאסטר צמח אינו עשוי מתבנית. במקום זאת, יצירותיהם תלויות בספציפית של האנזימים הנמצאים ברקמות שהופכות את הפולימרים תאיים אלה. ככזה, אנליזות כימיות של מרכיב רכיבים קריטיים להבין הרכב פוליאסטר שומנים.
שיטות כימיות לדבוק אג"ח אסתר כוללות סבון, hydrogenolysis, transmethylation-זרז חומצה, ו- זרז בסיס transmethylation 2. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות. סבון מייצר חומצות שומן חופשיות הידרוקסי שיכול לעבור תגובות המשניות. Hydrogenolysis עם ליתיום אלומיניום הידריד (4 LiAlH) 16 שמש במשך ניתוח cutin 7. Hydrogenolysis מפחית פחמנים פונקציונליות לאלכוהול והמבנים המקוריים צריכים להסיק על ידי deuteriolysis עם deuteride אלומיניום ליתיום (LiAlD 4).חסרון של גישה זו הוא הדרישה של GC / MS ברזולוציה גבוהה כדי להשוות את מידת deuteriation של polyols השומן שהושג לעשות משימות של המבנים שלהם. transesterification זרז-חומצה עם trifluoride ורון methanolic (BF 3) כבר בשימוש תכוף בdepolymerizations cutin ושַׁעֲמָן 8,17,18, אבל יש מגיב חיי מדף מוגבלים ועשוי להציג את החפצים בשל תופעות תגובות 15. חומצה גופרתית methanolic גם תשואות אסטרים מתיל של מונומרים אבל עם פרופורציות גדולות יותר של חומצות שומן 2-הידרוקסי, אשר ככל הנראה לא רכיבי פוליאסטר השומנים נכונים, בהשוואה לשיטות אחרות 10.
שיטת transesterification הזרז-NaOMe המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת אסטרים מתיל חומצת השומן שderivatized על ידי silylation של קבוצות הידרוקסיל, מתן ספקטרום מסה אופייני לזיהוי, או על ידי acetylation לספק נגזרים יציבים יותר של קבוצות הידרוקסיל FOכימות r. חסרון אחד של שיטה זו הוא שהידרוליזה מתחרה עם transesterification כאשר המים נמצאים בתגובה. מים מגיבים עם NaOMe (הזרז) ומייצרים NaOH, אשר בתורו hydrolyses אסטרים מתיל חומצת שומן להניב חומצות חופשיות (איור 2 ד). זה צד תגובה רצויה משום ששתי פסגות תהיה נוכחת לכל חומצת שומן: תיל אסטר ונגזר אסתר TMSi, ובכך מסבכים את הניתוח. שימוש בחומרים כימיים נטול מים והוספה מתיל אצטט כשיתוף ממס להתחרות עם סבון הם צעדים חיוניים ובכך למנוע הידרוליזה (איור 2 ד).
Cutin ושַׁעֲמָן מכילים בין גליצרול 1 ו -26% 4. עם זאת, מונומר זה לא יזוהה על ידי תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול זה. גליצרול הוא הידרופילי מאוד, ובניגוד למונומרים התיל אסטר חומצת שומן, יבוטל במהלך שלבי ממס השטיפה מימיים. מגבלה זו גםpplies לשיטות אחרות cutin depolymerization, אבל גליצרול ניתן לקבוע בשכבה המימית המתקבלת לאחר transesterification באמצעות שיטה האנזימטית. לחלופין, ניתן לכמת באמצעות תנאים מתונים יותר (לדוגמא., 0.05 M NaOMe) ללא מיצוי במים נוסף כדי לזהות את כל מונומרים, כולל גליצרול 19,20 .Although שימושי לצורך כימות גליצרול, תנאים קלים בדרך כלל לתת depolymerization שלם של cutin ו שַׁעֲמָן.
אם GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID) זמין, ניתן לנתח את כל משכפל במכשיר זה למטרות כמותי, אחרי פסגות של מדגם מייצג זוהו על ידי GC / MS. לחלופין, ניתן לזהות מונומרים בGC / עקבות FID אם ידועים מדדי שימורם. יש גלאי יינון הלהבה גבוהה במיוחד רגישות ומגוון רחב של מידתיות, שהוא קריטי לכימות של רכיבי מדגם גדולים והקטניםבריצות יחידה. בנוסף, הוא חזק וקל לתחזוקה ותפעול 15.
הפרוטוקול המתואר מאפשר הבידוד, זיהוי, וכימות אמין ושחזור של מונומרים פוליאסטר שומנים צמחיים, המאפשר אפיון הכימי של מוטציות שונות בהרכב של מונומרים פוליאסטר שומנים אחד או יותר. ההליך הוא מדרגי, זה יכול להתאים בקלות לעבד כמויות קטנות וכמות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כוללים שורשים, זרעים, עלים, גבעולים ופרחים. נתוני רפאים המוניים של מונומרים פוליאסטר שומנים ממינים רבים שפורסמו לדוגמא., 21-26 ומהווים משאבים יקרי ערך כדי לזהות מונומרים ידועים מתי התאמת פרוטוקול זה לרקמות ו / או מינים אחרים. שיטה זו ישימה לחקירות של ביוסינתזה, רגולציה, וההפצה של פוליאסטר שומנים בצמחים גבוהים יותר.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |