Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
النباتات الوعائية تعتمد على طبقات الخلية التي تعمل كحواجز للماء بين الأنسجة النباتية والبيئة الخارجية. هذه الهياكل المرتبطة جدار الخلية محبة للدهون تقيد العدوى المسببة للأمراض وتنظم النقل السلبي من الغازات والماء والمواد الذائبة ويخرجون من الأنسجة النباتية 1. هذه الحواجز هي بشرة النبات، هيكل synapomorphic فريدة من نوعها للنباتات 2، ومختلف الحواجز نشر المحتوية على سوبيرين. بشرة طبقة أليف الزيت توليفها من قبل خلايا البشرة وملزمة لهم عبر طبقة pectinaceous على الجانب خارج الخلية من جدار الخلية 3-5. ذلك يغلف أجهزة جوية الأولية من النباتات العليا، يعمل كواجهة الحيوية بين أنسجة النبات والبيئة.
كوتين، المصفوفة الهيكلية للبشرة، وسوبيرين نوعان من البوليستر glycerolipid غير قابلة للذوبان المرتبطة الشموع المذيبات القابلة للاستخراج 2،4. هذه ل البوليمروتتكون ipids المشبعة وغير المشبعة مشتقات حمض الدهنية وكلاهما هيكليا ووظيفيا مماثل. ومع ذلك، فهي تمييزها عن الاختلافات المميزة في تكوين وترسيب مواقع كيميائية.
سوبيرين هو البوليستر الأليفاتية تقع داخل جدران الخلايا من بعض الأنسجة الخارجية والداخلية تشكيل الجدار الثانوي. وتشمل الأنسجة Suberized periderms الجذور والدرنات وأوراق الشجر، البشرة الداخلية الجذر، طبقات غلاف البذرة، والجروح تلتئم 2. على عكس كوتين، والبوليستر سوبيرين يحتوي عادة الكحول، المشبعة وغير المشبعة الأحماض أحادية ثنائي الكربوكسيل، ونسبة كبيرة من أحادية سلسلة طويلة جدا (C≥20).
كوتين هو البوليستر الدهون الأكثر وفرة في النباتات الوعائية 6، ويتكون من الجلسرين وC16-C18 مشتقات الأحماض الدهنية interesterified، مثل هيدروكسي وهيدروكسي الايبوكسي استبدال الأحماض الدهنية 4. في حين أن تكوين البوليمرات كوتينيتفاوت بين الأنواع tracheophyte، وأحادية الأولية الأكثر الغالبة هي 10، 16 dihydroxy 16: 0، 18-هيدروكسي-9،10-الايبوكسي 18: 0، و9،10،18-trihydroxy 18: 0 الأحماض الدهنية. وتتألف ومن المثير للاهتمام، ورقة نبات الأرابيدوبسيس ووقف كوتين أساسا من 18: 2 حمض ثنائي الكربوكسيل 7،8.
البشرة المصنع أيضا تقديم تفاوتا كبيرا في سماكة تتراوح من بضعة نانومتر إلى عدة ميكرومتر 9. منذ بشرة العزلة هي خطوة شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وخاصة بالنسبة البشرة ورقة رقيقة جدا مثل تلك التي من نبات الأرابيدوبسيس thaliana 8، وقد تم تطوير الأساليب التي تجاوز بشرة العزلة والتحقق من صحة 7،8. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لدراسة تكوين مونومر من كوتين في أوراق نبات الأرابيدوبسيس thaliana التي كتبها ميثوكسيد الصوديوم (NaOMe) التحلل -catalyzed واللوني للغاز لاحق / قياس الطيف الكتلي (GC / MS) التحليل. هذا البروتوكول يوفر وسيلة قوية لمعايرة المشاركوقد تم تكييف mposition من البوليستر الدهون النباتية في أنسجة delipidated كلها، ومن البروتوكولات ذكرت سابقا 7،10،11. عينات الأنسجة كلها هي أول المتجانس وdelipidated شامل، وإزالة الدهون المذيبات للاستخراج بما في ذلك جليدية والشموع epicuticular، والدهون غشاء، وtriacylglycerols. ثم يتم depolymerized خلية بقايا التخصيب الجدار إلى المكونة أحادية استر الميثيل من خلال الصوديوم المحفز ميثوكسيد تحلل الميثانول. يتم استخراج الدهنية استرات الميثيل الحمضية على تحمض، وderivatized للحصول على المقابلة trimethylsilyl أو الاسيتيل المشتقات. بقايا Derivatized متقلبة للغاية، ويمكن مزال من عمود اللوني للغاز عند درجة حرارة معقولة دون تغيير التشكل الهيكلي خلال تحليل GC / MS.
على عكس البوليمرات الحيوية الأخرى مثل الحمض النووي والبروتينات، ليست مصنوعة البوليستر الدهون النباتية من قالب. بدلا من ذلك، مؤلفاتهم تعتمد على خصوصية الإنزيمات الموجودة في الأنسجة التي تجعل من هذه البوليمرات خارج الخلية. كما يحلل هذا القبيل، كيميائي للناخب عناصر حاسمة لفهم تكوين البوليستر الدهون.
الطرق الكيميائية ليلتصق السندات استر تشمل التصبين، hydrogenolysis، نقل الميثيل الحمضية المحفز، والمحفز قاعدة نقل الميثيل 2. كل منهم لديه مزايا وعيوب. التصبين تنتج حرة الأحماض الدهنية هيدروكسي التي يمكن أن تفاعلات الثانوية. Hydrogenolysis مع هيدريد الليثيوم الألمنيوم (LiAlH 4) 16 استخدمت لتحليل كوتين 7. Hydrogenolysis يقلل الكربون functionalized إلى الكحول وتحتاج الهياكل الأصلية ليتم الاستدلال على ذلك من خلال deuteriolysis مع ديوترايد الليثيوم الألومنيوم (LiAlD 4). العيب هذا النهج هو شرط عالية الدقة GC / MS لمقارنة درجة deuteriation من البوليولات الدهنية التي تم الحصول عليها لجعل المهام هياكلها. وقد أسترة حمض المحفزة مع المثيلي فلوريد البورون (BF 3) كثيرا ما تستخدم في كوتين وسوبيرين depolymerizations 8،17،18، ولكن رد الفعل لديه صلاحية محدودة ويمكن أن يعرض القطع الأثرية المقرر إلى جانب ردود الفعل 15. حامض الكبريتيك المثيلي ينتج أيضا استرات الميثيل للأحادية ولكن مع نسب أكبر من الأحماض الدهنية 2-هيدروكسي، التي يفترض أن لا مكونات البوليستر الدهون الحقيقية، بالمقارنة مع الطرق الأخرى 10.
طريقة أسترة NaOMe المحفزة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج الأحماض الدهنية استرات الميثيل التي derivatized بواسطة silylation من مجموعات الهيدروكسيل، وتوفير مميزة أطياف الكتلة لتحديد الهوية، أو عن طريق أستلة لتوفير المشتقات أكثر استقرارا من مجموعات الهيدروكسيل FOص الكمي. عيب واحد من هذه التقنية هو أن التحلل يتنافس مع أسترة عندما تكون المياه موجودة في رد الفعل. يتفاعل الماء مع NaOMe (المحفز) وتنتج هيدروكسيد الصوديوم، والذي بدوره تتحلمأ الدهنية استرات الميثيل لانتاج حامض الأحماض الحرة (الشكل 2D). هذا هو رد فعل الجانب غير مرغوب فيه لقمتين سوف يكون حاضرا لكل الأحماض الدهنية: استر الميثيل واستر مشتق TMSI، مما يعقد التحليل. باستخدام الكواشف اللامائية وإضافة خلات الميثيل بوصفه مشاركا من المذيبات للتنافس مع التصبين خطوات بالتالي حاسمة لمنع التحلل (الشكل 2D).
كوتين وسوبيرين تحتوي على ما بين 1 و 26٪ الجلسرين 4. ومع ذلك، لن يتم الكشف عن هذه مونومر بسبب الظروف التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول. الجلسرين هو ماء للغاية، وعلى عكس الأحماض الدهنية أحادية استر الميثيل، سيتم القضاء خلال الخطوات المذيبات غسل المائية. هذا القيد أيضايمكن تحديد pplies إلى طرق التحلل كوتين أخرى، ولكن الجلسرين في الطبقة المائية التي تم الحصول عليها بعد أسترة باستخدام أسلوب الأنزيمية. بدلا من ذلك، يمكن قياسها كميا باستخدام أوضاع أكثر اعتدالا (على سبيل المثال، 0.05 M NaOMe) دون مزيد من استخراج المياه للكشف عن أحادية، بما في ذلك الجلسرين 19،20 .على الرغم من المفيد لغرض الجلسرين الكمي، ظروف معتدلة عادة ما تعطي التحلل غير الكامل للكوتين و سوبيرين.
إذا كان GC بالإضافة إلى كاشف اللهب التأين (ااا) هو متاح، جميع مكررات يمكن تحليلها في هذا الصك لأغراض الكمية، بعد أن تم التعرف على قمم عينة تمثيلية من قبل GC / MS. بدلا من ذلك، يمكن تحديد أحادية في GC / آثار ااا إذا عرفت مؤشرات الاحتفاظ بها. كاشف تأين اللهب لديه حساسية عالية خاصة ومجموعة واسعة من التناسب، وهو أمر حاسم لتقدير مكونات العينة الرئيسية والثانويةفي أشواط واحد. وبالإضافة إلى ذلك، فمن قوي وسهل لصيانة وتشغيل 15.
بروتوكول صفها يسمح للموثوقة وقابلة للتكرار العزلة، وتحديد، وتقدير حجم الدهون النباتية أحادية البوليستر، والسماح للتوصيف الكيميائي للطفرات التي تختلف في تكوين واحد أو أكثر من الدهون أحادية البوليستر. هذا الإجراء هو تحجيم، ويمكن أن تتكيف بسهولة لمعالجة كميات سواء الصغيرة والسائبة من مختلف المواد النباتية، بما في ذلك الجذور والبذور والأوراق والسيقان والأزهار. وقد تم نشر البيانات الطيفية الجماعية للدهون أحادية البوليستر من العديد من الأنواع مثل، 21-26 وتشكل الموارد القيمة لتحديد أحادية غير معروفة عند التكيف مع هذا البروتوكول إلى الأنسجة و / أو الأنواع الأخرى. هذه الطريقة تنطبق على تحقيقات الحيوي، والتنظيم، وتوزيع البوليستر الدهون في النباتات العليا.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |