This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
В 2006 году, новый подход был описан перепрограммировать соматические клетки в плюрипотентные государства. После предварительный скрининг массива потенциальной перепрограммирования факторов фибробластов мыши могут быть успешно преобразованы в так называемой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPS) по ретровирусной трансдукции и избыточной экспрессии четырех транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc) 1. Впоследствии эта методика эффективно воспроизведена с помощью соматических клеток другого вида млекопитающего, включая человека, обезьяны 2 3 4 крыс, собак, 5, 6 овец и свиней 7. Кроме того, модифицированный протоколы опуская или замены потенциально онкогенного фактора транскрипции c-MYC были опубликованы 8, 9.
Независимо от начальной перепрограммирования приблизиться к истинным плюрипотентности растущих колоний должно быть подтверждено, трудоемкий и трудоемкой задачей. Основным недостаткомбольшинства этих анализов является то, что они не могут быть выполнены на живых клетках. Штатные факторы плюрипотентности, таких как Oct4, Sox2, NANOG или Rex1 представляют факторы транскрипции, расположенные в ядре и их обнаружение требует фиксации клеток, предшествующих иммуногистохимии или лизис клеток для RT-PCR анализа 10 -. 12 После этого, эти клетки будут потеряны для будущего Эксперименты, требующие дублирующие культуры каждой колонии.
Таким образом, технология, чтобы проанализировать плюрипотентность на живые клетки является весьма желательным. Несколько подходов действительно могут быть выполнены непосредственно на живых клетках с использованием антител, направленных против мембранных антигенов на основе (например,. TRA-1-60, SSEA4) 12, флуоресцентный сообщили красители для обнаружения щелочной фосфатазы 13 или малые молекулы, которые специфически этикетке эмбриональных стволовых (ES) и плюрипотентных клеток 14. Тем не менее, эти антитела могли бы, тем не менее отрицательно влиять на клетки и каждый метOD ограничивается одной плюрипотентности маркера. Наконец, флуоресцентные молекулярные маяки, двойной антисмысловые олигонуклеотиды с крутыми структур, которые позволяют живой окрашивание клеток, были описаны 15. Хотя этот подход может быть применен ко многим генам, метод требует nucleofection из суспензии отдельных клеток, которые не применим к растущей плюрипотентных колоний.
Пару лет назад наночастицы генов конкретного были описаны для анализа сурвивина выражение в человеческих SKBR3 клеток рака молочной железы 16. Эта рукопись описывает новый инновационный подход к обнаружения маркеров плюрипотентности в живых ES и плюрипотентных клеток путем использования наночастиц золота конъюгатов. Эти наночастицы состоят из центрального золотой частицы с сочетании захвата нити, несущей комплементарную последовательность РНК и Су3-меченого репортер прядь. Флуоресцентный сигнал репортерного нити гасят центральной частиц золота. Кроме того, целесообразнонаночастицы служат положительные и отрицательные элементы управления, соответственно (рисунок 1). Для применения наночастиц просто добавляются к культуральной среде (рис 2) и проникать в клетки с помощью эндоцитоза (рисунок 3). Если РНК-мишени выражается он вытесняет репортер прядь, которая испускает флуоресцентный сигнал. Этот метод не требует манипуляций с клеткой-мишенью и экспрессии гена-мишени может контролироваться оптически под флуоресцентным микроскопом непосредственно в живых клетках. Кроме того, эта технология может быть применена к любой желаемой гена-мишени между видами в случае плюрипотентных клеток и, таким образом, может быть использован в различных областях исследований. Наконец, проточной цитометрии анализа позволяют выявить и обогащение Cy3 положительных клеток.
Данная работа описывает использование флуоресцентных помечены наночастиц, которые позволяют достоверную оценку экспрессии гена внутриклеточного непосредственно в живых клетках из разных видов млекопитающих с разнообразными гистогенетических происхождения под флуоресцентным микроскопом. Этот подход имеет несколько преимуществ по сравнению с другими известными методами. Прежде всего исследователь не ограничивается по отношению либо к гену-мишени или клеточного типа. Все антитела на основе методов обнаружения ограничивается одной эпитоп. Хотя флуоресцентные молекулярные маяки могут быть разработаны для широкого спектра генов, этот метод требует диссоциации клеток и последующее nucleofection 15. В противоположность этому, применение наночастиц геноспецифических не требует манипуляций с клеткой-мишенью, который поглощает наночастиц активнее эндоцитоза. При последующем пассирования частицы золота постепенно оставить клетки и культуральную может быть использован в downstreaм эксперименты.
Тем не менее, эта технология все еще имеет некоторые ограничения. Некоторые маркеры, очевидно, не обнаруживается из-за их углеводной природы, такие как SSEA-1 или TRA-1-81 20. В настоящее время большой массив наночастиц в продаже. Эти частицы были предварительно тестировали на их функциональности в клеточных экспериментов. Целью данной работы заключалась в разработке пользовательских зондов, которые могут быть использованы границ вида. Когда после такого подхода при проектировании или зонд для нового гена-мишени нужно быть в курсе, что функциональность в кремнии предсказал зонд должен быть тщательно оценены в пробирке. NANOG-SF3 зонд, который показал 100% -ную гомологию к последовательности гомологии не работать вообще, а NANOG-SF1 с одной несогласованной базе в мышиных и свиной последовательности производится приятный сигнал флуоресценции. Другой вопрос относится к эффективному поглощению наночастиц. Частицы введитеклетки по эндоцитоза, процесс, который зависит от размера наночастиц 21, типа клеток и статуса дифференцировки и 22 сотовой возможность выполнять phago- и макропиноцитозом 23. Оптимальная концентрация, чтобы получить удовлетворительный сигнал флуоресценции должна быть проверена для каждого отдельного применения или клеточной линии. С этой целью первый эксперимент должен быть всегда применение контроля поглощения для оценки совместимости зондов в пределах типов клеток и условий культивирования прежде чем перейти к мишень-специфической обнаружение экспрессии генов.
Критическая точка для получения надежных результатов при применении этого протокола к новому клеточной линии или популяции клеток является включение соответствующего контроля. Постоянно флуоресцирующих управления поглощение обеспечит подсказку, которые концентрации наночастиц будет индуцировать достаточное сигнал флуоресцентного в популяции клеток-мишеней. Флуоресценции должны быть оценкид на следующий день в качестве сигнала будет исчезать с течением времени 17. В то же время управление скремблирования без аналога в геноме эукариот, приложенной в идентичной концентрация должна вызвать незначительное фонового сигнала. В качестве третьего управления целесообразно использовать наночастицы для конкретного гена домашнего хозяйства (например, GAPDH, β-актина). Эти наночастицы служат в качестве положительного контроля, что этот подход может быть использован для обнаружения специфическую экспрессию генов в выбранном популяции клеток-мишеней. Если эти элементы управления оказываются удовлетворительными, можно ожидать, чтобы получить надежные конкретные флуоресцентные сигналы с помощью наночастиц, специфические для других генов-мишеней. Концентрация применяемых наночастиц также может иметь решающее значение, поскольку они, как было показано понижающей регуляции последовательность-мишень 24. Тем не менее, этот эффект требует более высокие концентрации (5 нм), чем концентрации, используемые в экспериментах, представленных здесь (400 пМ). При этой концентрации nanoflaразрешения не влияют на мРНК гена-мишени или уровни белка и концентрации, как высокие, как 2 нМ не ослабляют пролиферацию HEK293 и мышиных ЭС клеток 17. Кроме того, весь анализ экспрессии генома не выявили каких-либо существенных изменений в экспрессии генов, 25. Таким образом, при концентрациях до 1 нм nanoflares не должен иметь никаких важных побочных эффектов.
Очень перспективно применение этой технологии является возможность маркировать любую данную популяцию клеток, который отмечается по конкретной гена. Недавно наночастицы генов конкретного успешно используется для избирательного окрашивания живых желудочковых миоцитов 26, субпопуляции клеток меланомы 27, моноциты 28 и мозжечковая клеточных культур 29. Такие флуоресценции маркировку клеточные популяции могут быть отсортированы и очищали с помощью проточной цитометрии, как живые клетки. В области онкологии это можно себе представить, чтобы изолировать живые метастатические опухолевые клетки на животных моделяхна основе их выражения CEA, самое ценное для поиска потенциального метастазов способствующего гены или целевые структуры. Недавно мы показали, что действительно перепрограммировать мышиные плюрипотентных колонии могут быть идентифицированы на месте с Nanog-специфических наночастиц на основе обнаруженного интенсивности флуоресценции 17. Таким образом, идентификация действительно перепрограммировать колонии плюрипотентных может быть выполнена на высоких платформах пропускная способность, которые используют робота обнаружение флуоресценции и выбрать устройства для выявления наиболее перспективных колонии. Эта технология появляется, чтобы быть пригодным во многих областях исследований, чтобы выбрать клеточные субпопуляции конкретных и, кажется, можно применять наночастицы в высоких платформах производительность. В заключение, этот протокол представляет собой новый подход с использованием флуоресценции помечены наночастиц, который позволяет обнаруживать выражения внутриклеточного гена непосредственно в живых клетках. Эта технология может быть ценным инструментом для очистки, расширения и дальнейшего характерИзе редкие клеточные субпопуляции во многих областях исследований.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |