This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
Im Jahr 2006 wurde ein neuer Ansatz beschrieben somatischen Zellen in einem pluripotenten Zustand neu zu programmieren. Vorabsiebung einer Anordnung von potentiellen Reprogrammierungsfaktoren murine Fibroblasten konnten sogenannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die durch retrovirale Transduktion und die Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren erfolgreich umgewandelt werden (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Anschließend wurde diese Technik effektiv mit somatischen Zellen von verschiedenen Säugetierspezies, einschließlich Menschen, 2, 3 Affen, Ratten, 4, 5 Hunde, Schafe und Schweine 6 7 reproduziert worden. Darüber hinaus modifiziert Protokolle Weglassen oder Austausch des potentiell onkogenen Transkriptionsfaktor c-myc veröffentlicht wurden 8, 9.
Unabhängig von der Anfangs Umprogrammierung Ansatz die wahre Pluripotenz der wachsenden Kolonien muss bestätigt werden, eine mühsame und zeitraubende Aufgabe. Ein Hauptnachteilder Mehrheit dieser Analysen ist, dass sie nicht an lebenden Zellen durchgeführt werden. Etabliert Pluripotenz Faktoren wie OCT4, SOX2, NANOG oder REX1 repräsentieren Transkriptionsfaktoren im Zellkern befindet und deren Nachweis erfordert Fixierung der Zellen vor der für die RT-PCR-Analyse 10 Immunhistochemie oder Zelllyse. – 12 Danach werden diese Zellen für die Zukunft verloren Experimente Replika-Kulturen jeder Kolonie erforderlich ist.
Somit ist eine Technologie zur Pluripotenz an lebenden Zellen analysieren, sehr wünschenswert. Verschiedene Ansätze können in der Tat direkt an lebenden Zellen unter Verwendung von Antikörpern, die gegen membranbasierten Antigene durchgeführt werden (z. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluoreszierende Farbstoffe berichtet an alkalische Phosphatase 13 oder kleine Moleküle, die spezifisch zu markieren embryonale Stammzellen zu erkennen (ES) und iPS-Zellen 14. Allerdings könnten die Antikörper dennoch negativ auf die Zellen und jede Method auf eine einzige Pluripotenz Marker beschränkt. Schließlich Fluoreszenz Molecular Beacons, Dual-Antisense-Oligonukleotide mit Haarnadelstrukturen, die Live-Färbung von Zellen zu ermöglichen, wurden beschrieben, 15. Obwohl dieser Ansatz für viele Gene angewendet werden, erfordert die Technik Nukleofektion einer Einzelzellsuspension, die nicht für wachsende iPS Kolonien.
Ein paar Jahre her Gen-spezifischen Nanopartikel wurden beschrieben, um Survivin Expression in menschlichen SKBR3 Brustkrebszellen 16 zu analysieren. Diese Handschrift beschreibt ein neues innovatives Konzept für die Erfassung Pluripotenzmarker in Live-ES und iPS-Zellen durch die Verwendung von Gold-Nanopartikel-Konjugate. Diese Nanopartikel bestehen aus einer zentralen Goldpartikel mit einem gekoppelten Abfangstrang Durchführung der komplementären RNA-Sequenz und ein Cy3-markiertem Reporterstrang. Das Fluoreszenzsignal des Reporterstrang wird von der zentralen Goldpartikel abgeschreckt. Darüber hinaus empfiehltNanopartikel dienen als negative und positive Kontrollen, bzw. (Abbildung 1). Für eine Anwendung, die Nanopartikel sind einfach zu dem Kulturmedium (Abbildung 2) aufgenommen und in die Zellen über Endozytose (Abbildung 3). Wenn die Ziel-RNA exprimiert wird, verdrängt es das Reporterstrang, der dann ein Fluoreszenzsignal emittiert. Dieses Verfahren erfordert keine Manipulation der Zielzelle und die Expression des Zielgens kann optisch unter einem Fluoreszenzmikroskop direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Ferner kann die Technik auf jeden gewünschten Ziel-Gens zwischen den Arten bei iPS Zellen angewendet werden, und somit kann in vielen verschiedenen Forschungsgebieten verwendet werden. Schließlich durchflusszytometrischen Analysen ermöglichen die Identifikation und Anreicherung von Cy3-positiven Zellen.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nanoteilchen, welche die sichere Auswertung der intrazellulären Genexpression direkt in lebenden Zellen aus verschiedenen Säugetierarten mit diversen histogenetischen Herkunft unter einem Fluoreszenzmikroskop ermöglichen. Dieser Ansatz hat eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen veröffentlichten Verfahren. Zunächst der Forscher nicht in Bezug auf entweder das Zielgen oder Zelltyp beschränkt. Alle Antikörper-basierten Nachweisverfahren sind auf ein einzelnes Epitop beschränkt. Obwohl fluoreszierende molekulare Signale können auch für ein breites Spektrum von Genen entwickelt werden, erfordert dieses Verfahren die Dissoziation der Zellen und anschließende Nukleofektion 15. Im Gegensatz dazu wird die Anwendung der genspezifischen Nanopartikel keine Manipulation der Zielzelle, die die Nanopartikel aktiv von Endozytose verschlingt erforderlich. Während der anschließenden Passage der Goldteilchen nach verlassen der Zellen, und die Kultur kann in downstrea verwendet werdenm Experimenten.
Dennoch hat auch die Technologie immer noch einige Einschränkungen. Einige Marker sind offensichtlich nicht nachweisbar aufgrund ihrer Kohlenhydrat Natur wie SSEA-1 oder TRA-1-81 20. Derzeit ist eine große Anordnung von Nanopartikeln im Handel erhältlich. Diese Teilchen wurden für ihre Funktionalität in zellulären Experimenten vorgetestet worden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, kundenspezifische Sonden, die über Artgrenzen Grenzen verwendet werden können, zu entwickeln. Wenn nach einem solchen Annäherung oder beim Entwerfen einer Sonde für ein neues Ziel-Gen hat man sich bewusst sein, dass die Funktionalität eines in silico vorhergesagten Sonde muss sorgfältig in vitro untersucht werden können. Die NANOG-SF3 Sonde, die eine 100% Homologie zu der Sequenzhomologie zeigten überhaupt nicht arbeiten, während NANOG-SF1 mit einem fehlgepaarten Basen im murinen und Schweine-Sequenz erzeugt einen schönen Fluoreszenzsignal. Eine andere Frage bezieht sich auf die effiziente Aufnahme der Nanopartikel. Die Partikel gebendie Zellen durch Endozytose ein Verfahren, das durch die Größe der Nanopartikel 21 beeinflusst, wird der Zelltyp und der Differenzierungsstatus 22 und die zelluläre Fähigkeit zum phago- zuführen und Makropinozytose 23. Die optimale Konzentration, eine befriedigende Fluoreszenzsignal zu erhalten, muss für jede einzelne Anwendung oder Zelllinie getestet werden. Zu diesem Zweck sollte das erste Experiment immer die Anwendung der Aufnahmesteuerung, die Kompatibilität der Sonden innerhalb der Zelltypen und Kulturbedingungen, bevor sie zu Ziel-spezifischen Nachweis von Genexpression zu bewerten.
Ein kritischer Punkt, um zuverlässige Ergebnisse bei der Anwendung dieses Protokolls auf eine neue Zelllinie oder Zellpopulation ist die Einbeziehung von geeigneten Kontrollen zu erhalten. Die immer fluoreszierende Aufnahme Kontrolle zeigt einen Hinweis, welche Konzentrationen von Nanopartikeln wird eine ausreichende Fluoreszenzsignal in der Zielzellpopulation zu induzieren. Die Fluoreszenz zu bewerten müssend am nächsten Tag wie das Signal wird mit der Zeit 17 verblassen. Gleichzeitig die Verschlüsselungssteuerung ohne ein Gegenstück in der eukaryontischen Genom an einer gleichen Konzentration aufgetragen muß eine vernachlässigbare Hintergrundsignal hervorzurufen. Als dritte Steuer ist es ratsam, ein Nanopartikel spezifisch für ein Housekeeping-Gen (zB GAPDH, β-Actin) zu verwenden. Diese Nanopartikel dienen als positive Kontrolle, dass der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Gen-Expression in den ausgewählten Zielzellpopulation zu detektieren. Wenn diese Kontrollen drehen zufrieden kann man erwarten, zuverlässige spezifische Fluoreszenzsignale unter Verwendung spezifisch für andere Zielgene Nanopartikeln erhalten. Die Konzentration der verwendeten Nanopartikel können ebenfalls kritisch sein, da sie gezeigt haben, herunterregulieren die Zielsequenz 24. Dieser Effekt erfordert jedoch viel höhere Konzentrationen (5 nM) als die in den hier beschriebenen Experimenten (400 pM) dargestellt verwendeten Konzentrationen. Bei dieser Konzentration die nanoflares nicht beeinträchtigen Zielgen-mRNA oder Proteinniveaus und hohen Konzentrationen von 2 nM die Proliferation von HEK293 und murine ES-Zellen 17 nicht beeinträchtigen. Darüber hinaus fand eine ganze Genom-Expressionsanalyse zeigen keine signifikanten Veränderungen in der Genexpression 25. Daher bei Konzentrationen bis zu 1 nM die nanoflares sollte nicht zeigen alle wichtigen Nebenwirkungen.
Eine sehr vielversprechende Anwendung dieser Technologie ist die Möglichkeit, eine gegebene Zellpopulation, welche von einem spezifischen Gen markiert ist etikettieren. In jüngerer Zeit wurden genspezifische Nanopartikel erfolgreich verwendet worden, um selektiv färben Live ventrikulären Myozyten 26, Subpopulationen von Melanomzellen 27, Monozyten 28 und Kleinhirnzellkulturen 29. Solche fluoreszenzmarkierten Zellpopulationen können sortiert und mittels Durchflusszytometrie als lebende Zellen gereinigt werden. In der Onkologie ist es vorstellbar, Live-metastatischen Tumorzellen in Tiermodellen zu isolierenauf der Basis ihrer Expression von CEA, für die Suche nach potentiellen Metastasen fördernde Gene oder Zielstrukturen wertvollsten. Wir haben kürzlich gezeigt, dass tatsächlich umprogrammiert murine iPS Kolonien können in situ mit Nanog -spezifischen Nanopartikel auf der Basis der detektierten Fluoreszenzintensität 17 identifiziert werden. Daher könnte die Identifikation der wirklich neu programmiert iPS Kolonien auf Hochdurchsatz-Plattformen, die Roboter-Fluoreszenzdetektion und Kommissionierung Geräte verwenden, um die vielversprechendsten Kolonien zu identifizieren durchgeführt werden. Diese Technologie scheint geeignet zu sein, in vielen Forschungsbereichen, um spezifische zelluläre Subpopulationen wählen und es scheint möglich, die Nanopartikel in Hochdurchsatz-Plattformen gelten. Zusammenfassend stellt dieses Protokoll einen neuartigen Ansatz unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nanopartikel, die den Nachweis von intrazellulären Genexpression direkt in lebenden Zellen ermöglicht. Diese Technologie kann ein wertvolles Instrument, um zu reinigen, ausbauen und weitere Zeichen seinize seltenen Zellpopulationen in vielen Forschungsbereichen.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |