This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
في عام 2006، وقد وصفت نهجا جديدا لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى دولة المحفزة. بعد الغربلة من مجموعة من إعادة برمجة المحتملة العوامل يمكن تحويلها الليفية الفئران بنجاح إلى ما يسمى يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (آي بي إس) من خلال تنبيغ فيروسات وoverexpression من أربعة عوامل النسخ (Oct4، Sox2، Klf4، ج. Myc على) 1. بعد ذلك تم إعادة إنتاج هذه التقنية بشكل فعال باستخدام الخلايا الجسدية من أنواع الثدييات المختلفة بما في ذلك البشر 2، 3 القرود والفئران 4، 5 الكلاب والأغنام والخنازير 6 7. بالإضافة إلى ذلك، تعديل بروتوكولات حذف أو استبدال عامل النسخ يحتمل أنكجنيك ج- MYC تم نشر 8، 9.
بغض النظر عن إعادة برمجة الأولية الاقتراب من تعدد القدرات الحقيقية للمستعمرات المتزايد لابد من تأكيد، وهي مهمة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. والعيب الرئيسيغالبية هذه التحليلات هو أنها لا يمكن أن يؤديها على الخلايا الحية. عوامل تعدد القدرات الراسخة مثل OCT4، SOX2، NANOG أو REX1 تمثل عوامل النسخ الموجود في نواة والكشف عنها يتطلب تثبيت الخلايا قبل المناعية أو تحلل الخلايا لتحليل RT-PCR 10 – 12 وبعد ذلك، يتم فقدان هذه الخلايا للمستقبل التجارب التي تتطلب تكرار الثقافات من كل مستعمرة.
وهكذا، وهي تقنية لتحليل تعدد القدرات على الخلايا الحية مرغوب فيه للغاية. يمكن في الواقع عدة طرق يتم تنفيذها مباشرة على الخلايا الحية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد المستضدات التي تعتمد على الأغشية (على سبيل المثال. TRA-1-60، SSEA4)، وأفاد 12 الفلورسنت الأصباغ للكشف عن الفوسفاتيز 13 أو صغيرة جزيئات القلوية التي تسمية تحديدا الجذعية الجنينية (ES) وخلايا الجذع 14. ومع ذلك، قد الأجسام المضادة مع ذلك تؤثر سلبا على الخلايا وكل المنهجياتيقتصر التطوير التنظيمي إلى تعدد القدرات علامة واحدة. وأخيرا، منارات الجزيئية فلوري، [أليغنوكليوتيد ثنائي العقاقير مع الهياكل دبوس الشعر، والتي تسمح تلطيخ حية من الخلايا، وقد وصفت 15. على الرغم من أن هذا النهج يمكن تطبيقها على العديد من الجينات، والأسلوب يتطلب nucleofection من تعليق خلية واحدة، وهو ما لا ينطبق على المتنامية الجذع المستعمرات.
وقبل عامين وقد وصفت النانوية الجينات المحددة لتحليل التعبير survivin في SKBR3 خلايا سرطان الثدي البشرية 16. تصف هذه المخطوطة نهجا مبتكرا جديدا للكشف عن علامات تعدد القدرات في ES الحية وخلايا الجذع من خلال استخدام تقارن جسيمات متناهية الصغر من الذهب. تتكون هذه الجسيمات النانوية من الجسيمات الذهب المركزي مع التقاط حبلا إلى جانب تحمل تسلسل الحمض النووي الريبي مكملة وحبلا مراسل CY3 المسمى. تطفأ إشارة الفلورسنت من حبلا مراسل من الجسيمات الذهب المركزي. بالإضافة إلى ذلك، مناسباالنانوية تخدم الضوابط سلبية وإيجابية، على التوالي (الشكل 1). لتطبيق تضاف النانوية ببساطة إلى مستنبت (الشكل 2) وتدخل الخلايا عن طريق الإلتقام (الشكل 3). إذا تم أعرب RNA الهدف هو إزاحة حبلا مراسل التي تنبعث ثم إشارة الفلورسنت. لا يتطلب هذا الأسلوب التلاعب في الخلية المستهدفة والتعبير عن الجينات المستهدفة يمكن رصد بصريا تحت المجهر مضان مباشرة في الخلايا الحية. وعلاوة على ذلك، فإن التكنولوجيا يمكن تطبيقها على أي جين الهدف المنشود عبر الأنواع في حالة خلايا الجذع، وبالتالي قد تكون استخدمت في العديد من المجالات البحثية المختلفة. وأخيرا، يحلل تدفق cytometric تسمح بتحديد وإثراء خلايا إيجابية CY3.
يصف هذا العمل استخدام مضان المسمى النانوية التي تسمح للتقييم موثوق من داخل الخلايا التعبير الجيني مباشرة في الخلايا الحية من أنواع الثدييات المختلفة مع الأصل مكون للأنسجة متنوعة تحت المجهر مضان. هذا النهج لديه اثنين من المزايا بالمقارنة مع الطرق الأخرى المنشورة. أولا وقبل كل باحث لا يقتصر فيما يتعلق إما الجين المستهدف أو نوع من الخلايا. وتقتصر كل طرق الكشف الأجسام المضادة تستند إلى حاتمة واحدة. على الرغم من منارات الجزيئية الفلورسنت ويمكن أيضا أن تكون مصممة لطيف واسع من الجينات، يتطلب هذا الأسلوب في تفكك الخلايا وnucleofection لاحق 15. في المقابل، لا يتطلب تطبيق النانوية الجينات المحددة أي تلاعب في الخلية المستهدفة التي تكتنف النانوية بنشاط الإلتقام. خلال الركض لاحق من جزيئات الذهب ترك تدريجيا الخلايا والثقافة يمكن أن تستخدم في downstreaم التجارب.
ومع ذلك، فإن التكنولوجيا أيضا لا يزال لديه بعض القيود. بعض علامات ليست بالطبع يمكن اكتشافها نظرا لطبيعتها الكربوهيدرات مثل SSEA-1 أو TRA-1-81 20. في الوقت الحاضر، مجموعة كبيرة من الجسيمات النانوية هي متاحة تجاريا. تم pretested هذه الجسيمات حصول على وظائف في التجارب الخلوية. وكان الهدف من هذا العمل لتصميم تحقيقات مخصصة والتي يمكن استخدامها عبر الحدود الأنواع. عند اتباع هذا النهج أو عند تصميم التحقيق لرواية واحدة الجين المستهدف يجب أن يكون على علم بأن وظيفة لفي سيليكون وتوقعت يحتاج التحقيق لإجراء تقييم دقيق في المختبر. لم التحقيق NANOG-SF3 التي أظهرت تناظر 100٪ للتناظر تسلسل لا تعمل على الإطلاق في حين NANOG-SF1 مع قاعدة متطابقة واحد في الفئران والخنازير تسلسل المنتجة لطيفة إشارة مضان. سؤال آخر يشير إلى امتصاص فعال من الجسيمات النانوية. الجسيمات دخولالخلايا عن طريق الإلتقام، وهي العملية التي يتأثر حجم الجسيمات النانوية 21، ونوع من الخلايا وحالة التمايز 22 والقدرة الخلوية لأداء البلعمة؛ الأكل وmacropinocytosis 23. تركيز الأمثل للحصول على إشارة مضان مرضية لابد من اختبار لكل طلب فردي أو خط الخلية. وتحقيقا لهذه الغاية، ينبغي أن التجربة الأولى ستكون دائما تطبيق مراقبة امتصاص لتقييم مدى توافق تحقيقات داخل أنواع الخلايا والشروط الثقافة قبل أن ينتقل إلى استهداف محددة الكشف عن التعبير الجيني.
وهناك نقطة هامة للحصول على نتائج موثوقة عند تطبيق هذا البروتوكول إلى خط خلية رواية أو السكان الخلية هو إدراج ضوابط سليمة. سوف تحكم امتصاص الاستشعاع من أي وقت مضى توفير تلميحا التي تركيزات الجسيمات النانوية ستؤدي إلى إشارة فلوري كافية في السكان الخلية المستهدفة. مضان يجب تقييمد في اليوم التالي كما إشارة سوف تتلاشى مع مرور الوقت 17. في الوقت نفسه سيطرة التدافع دون نظيره في جينوم وحيد الخلية تطبيقها في تركيز مماثل يجب أن تحفز على إشارة الخلفية ضئيلة. كعنصر تحكم الثالثة فمن المستحسن استخدام جسيمات متناهية الصغر محددة لجين التجهيزات المنزلية (على سبيل المثال GAPDH، β-أكتين). هذه الجسيمات النانوية بمثابة مراقبة إيجابية أن النهج يمكن أن تستخدم لكشف محددة التعبير الجيني في السكان الخلية المستهدفة المحددة. إذا هذه الضوابط تتحول واحدة مرضية يمكن أن نتوقع الحصول على إشارات الفلورسنت محددة موثوقة باستخدام الجسيمات النانوية محددة لغيرها من الجينات المستهدفة. تركيز الجسيمات النانوية تطبيقها قد تكون أيضا عاملا حاسما كما ثبت أنها لأسفل تنظيم تسلسل الهدف 24. ومع ذلك، هذا التأثير يتطلب تركيزات أعلى من ذلك بكثير (5 نانومتر) من التركيزات المستخدمة في التجارب المقدمة هنا (400 م). في هذه تركيز nanoflaالدقة لا تؤثر على الهدف مرنا الجينات أو مستويات البروتين وتركيزات عالية تصل إلى 2 نانومتر لا تنال من انتشار HEK293 وخلايا الفئران ES 17. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل الجينوم التعبير كله لم تكشف عن أي تغييرات كبيرة في التعبير الجيني 25. ولذلك، بتركيزات تصل إلى 1 نانومتر وnanoflares لا ينبغي أن تظهر أي آثار سلبية هامة.
تطبيق واعد جدا من هذه التكنولوجيا هو إمكانية تسمية أية مجموعة من السكان خلية معينة التي تتسم جين معين. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بنجاح النانوية الجينات المحددة وصمة عار انتقائي myocytes البطين حي 26، القطعان من خلايا سرطان الجلد 27، وحيدات الخلية 28 و المخيخ الثقافات 29. هؤلاء السكان خلية بعلامات مضان ويمكن فرزها وتنقيتها عن طريق التدفق الخلوي الخلايا الحية كما. في مجال علم الأورام هو تصورها لعزل خلايا الورم النقيلي الحية في النماذج الحيوانيةعلى أساس التعبير عنها من CEA، الأكثر قيمة للبحث عن الانبثاث المحتملين تعزيز الجينات أو هياكل الهدف. نحن في الآونة الأخيرة أنه برمجتها حقا الجذع مستعمرات الفئران يمكن تحديدها في الموقع مع NANOG النانوية -specific على أساس كثافة مضان الكشف عن 17. لذلك، وتحديد المستعمرات الجذع برمجتها حقا يمكن أن يؤديها على منصات إنتاجية عالية، والتي تستخدم كشف مضان الروبوتية وأجهزة التقاط لتحديد المستعمرات الواعدة. هذه التقنية تبدو مناسبة في العديد من مجالات البحوث لتحديد مجموعات سكانية فرعية الخلوية محددة، ويبدو من الممكن تطبيق النانوية في منصات إنتاجية عالية. في الختام، ويمثل هذا البروتوكول نهجا جديدا باستخدام مضان المسمى النانوية التي تسمح للكشف عن الخلايا التعبير الجيني مباشرة في الخلايا الحية. هذه التكنولوجيا قد تكون أداة قيمة لتنقية وتوسيع وزيادة حرفإيزي القطعان الخلوية نادرة في العديد من المجالات البحثية.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |