This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
2006年,一种新的方法被描述为体细胞重编程到多能状态。预筛选潜在重编程的阵列的后因子鼠成纤维细胞,可以成功地转换到所谓的诱导多能干细胞(iPS)通过逆转录病毒转导和四种转录因子的过度表达(Oct4的,SOX2,KLF4,c-Myc的 )1。随后该技术被有效地使用不同的哺乳动物物种包括人类在内的2,3猴子,大鼠4,狗5,6羊和猪7的体细胞再生。此外,改性的协议漏报或替换潜在致癌转录因子C- MYC已经出版8,9。
不管初始重新编程接近生长的菌落的真正的多能性已被确认,费力和耗时的任务。主要缺点大多数这些分析的是,它们不能被活细胞上进行的。建立多能性因素,如OCT4,SOX2,NANOG或REX1代表位于细胞核转录因子和它们的检测要求到免疫组织化学或细胞裂解用于RT-PCR分析10之前的细胞的固定– 12之后,这些细胞被丢失供将来实验要求各殖民地的复制培养。
因此,一个技术来分析多能性活细胞上是非常需要的。几种方法确实可以在使用抗体的活细胞针对基于膜的抗原直接进行(例如。TRA-1-60,SSEA4)12,荧光报道染料来检测碱性磷酸酶13或小分子,其特异性地标记胚胎干(ES)和iPS细胞14。然而,这些抗体可能仍然不利地细胞和每甲基影响外径被限制为单个多能性标志物。最后,荧光分子信标,双反义寡核苷酸具有发夹结构,其允许细胞活染色,已经描述了15。虽然这种方法可以被应用到许多基因,该技术需要一个单一的细胞悬浮液,这是不适用的iPS生长菌落核转染。
几年前基因特异的纳米粒子已被描述分析Survivin表达人类SKBR3乳腺癌细胞16。这份手稿描述了一种新的创新的方法通过利用金纳米粒子结合物检测现场ES和iPS细胞多能性标志物。这些纳米颗粒由带耦合捕获链携带互补的RNA序列和Cy3标记记者链中的核心金颗粒。记者链的荧光信号是由中央金颗粒骤冷。另外,适当纳米颗粒用作阴性和阳性对照,分别为( 图1)。一个应用程序的纳米粒子被简单地加入到培养基中(图2),并通过内吞作用进入细胞(图3)。如果靶RNA表达它的排水量记者链,然后发出荧光信号。此方法不需要操纵靶细胞和靶基因的表达可以被光学地在荧光显微镜下在活细胞中监测直接。此外,该技术可以适用于各种物种中,iPS细胞的情况下,任何期望的靶基因,因此可以在许多不同的研究领域被采用。最后,流式细胞仪分析允许的Cy3阳性细胞的识别和充实。
目前的工作描述了使用荧光标记的纳米颗粒允许细胞内基因表达的可靠的评估直接在来自不同哺乳动物物种用荧光显微镜下多样组织发生起源的活细胞。这种方法有两个优点相比其他公布的方法。首先研究者并不限于与上述任何靶基因或细胞类型。所有基于抗体的检测方法被限制在一个单一的表位。虽然荧光分子信标,也可设计为基因的广谱性,这种方法需要的细胞和随后的核转染15的解离。与此相反,基因特异性纳米颗粒的应用不需要任何操纵哪些吞噬纳米颗粒积极通过内吞作用的靶细胞。在随后的传代金颗粒逐渐离开细胞和培养可以在downstrea使用米实验。
然而,该技术也有一些限制。一些标志物是明显不可检测由于它们的碳水化合物的性质如SSEA-1或TRA-1-81 20。目前,大阵纳米颗粒是市售的。这些颗粒已经预先测试其在细胞实验中的功能。本工作的目的是设计出可以跨越物种边界被用于定制探针。以下这样的方法时,或用于一种新颖的靶基因中的一个设计的探针时必须注意的,在硅片的功能预测探针需要在体外进行全面评估。所述NANOG-SF3探针同源性为100%的序列同源性并没有在所有的工作而NANOG-SF1与一个错配的碱基在鼠和猪的序列产生一个很好的荧光信号。另一个问题是指纳米颗粒的有效吸收。该粒子进入细胞通过内吞作用,这是由纳米颗粒21的尺寸的影响的方法,该细胞类型和分化状态22和蜂窝能力来执行phago-和巨吞23。的最佳浓度,以获得令人满意的荧光信号具有为每个单独的应用或细胞系进行测试。为此目的,第一实验始终应摄取控制的应用上移动到目标特异性检测基因表达之前评估所述探针内的细胞类型和培养条件的相容性。
一个关键点应用该协议时,一个新的细胞系或细胞群是包含适当的控制,以获得可靠的结果。不断荧光摄取控制将提供一个提示该纳米颗粒的浓度将引起在靶细胞群体的足够的荧光信号。荧光必须评估D中的第二天作为信号将随着时间而消逝17。在同一时间,而不在施加以相同浓度的真核基因组中的对应的扰频控制,必须诱导可忽略的背景信号。作为第三控制 最好是使用特异于持家基因的纳米颗粒(如GAPDH,β肌动蛋白 )。这些纳米颗粒充当阳性对照,该方法可用于检测特定基因的表达在所选择的靶细胞群体。如果这些控制转出令人满意的人们可以期待使用特异于其他靶基因的纳米粒子,以获得可靠的特异性荧光信号。所施加的纳米颗粒的浓度也可以是关键的,因为它们已被证明下调靶序列24。然而,这种效果需要高得多的浓度(5 nm)的比在这里(400分)呈现的实验中使用的浓度。在此浓度下的nanofla水库不影响靶基因的mRNA或蛋白水平和浓度高达为2nM不损害HEK293和鼠胚胎干细胞17的扩散。此外,全基因组表达分析没有发现的基因表达25任何显著改变。因此,在浓度高达1纳米的nanoflares应该不表现出任何重要的不利影响。
这种技术的一个非常有前途的应用是哪个标签带标记的特定基因的任何给定的细胞群体的可能性。最近,基因特异性的纳米颗粒已经成功地被用于选择性地染色活心肌细胞26,黑色素瘤细胞27的亚群,单核细胞28和小脑细胞培养物29。这种荧光标记的细胞群体可以被分类,并通过流式细胞仪作为活细胞中纯化。在肿瘤学领域中它是可以想象的分离活转移性肿瘤细胞在动物模型中基于它们的CEA的表达,针对搜索潜在转移促进基因或靶结构的最有价值的。我们最近表明真正重新编程鼠的iPS集落可以原位标识Nanog的基于所检测的荧光强度17特异性纳米颗粒。因此,真正的重新编程的iPS克隆鉴定可以在高通量平台,它使用机器人荧光检测和分拣设备,以确定最有前途的殖民地进行。此技术似乎是合适的,在许多研究领域以选择特定的细胞亚群,它似乎能够应用纳米颗粒在高通量平台。总之,本协议表示使用荧光标记的纳米颗粒,它允许细胞内基因表达的检测,直接在活细胞中一种新的方法。这种技术可能是一个有价值的工具,以净化,扩大和进一步字符IZE在许多研究领域罕见的细胞亚群。
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |