This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
2006 년, 새로운 접근 방식은 만능 상태로 체세포를 재 프로그래밍 설명했다. 가능한 리 프로그래밍의 배열 사전 선별 한 후 쥐과의 섬유 아세포가 성공적으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPS) 레트로 바이러스 형질 도입 및 네 개의 전사 인자의 과발현 소위 전환 될 수 인자 (인 Oct4, Sox2이, Klf4, C-Myc와 1). 이어서이 방법은 인간을 효과적으로 2, 3 원숭이, 쥐 4, 5 개, 양, 돼지 6 7 포함한 다른 포유류의 체세포를 이용하여 재현되었다. 또한, 프로토콜의 생략 또는 MYC가 8, 9를 발표 한 C-잠재적 발암 전사 인자를 교체를 수정했습니다.
관계없이 초기 프로그래밍의 성장 콜로니 진정한 능성이 힘들고 시간 소모적 인 작업을 확인하는 접근. 주요 단점이들 분석의 대다수가 살아있는 세포에서 수행 할 수 없다는 것이다. 이러한 OCT4, SOX2, NANOG 또는 REX1 설립 능성 인자 핵에있는 전사 인자를 나타내고, 그 검출은 RT-PCR 분석 (10)에 대해 면역 조직 또는 세포 용해에 앞서 세포의 정착이 필요 -. (12) 그 후,이 세포는 미래 손실 각 식민지의 복제 문화를 필요로하는 실험.
따라서, 살아있는 세포의 분화능을 분석하는 기술이 매우 바람직하다. 몇 가지 접근 방법은 참으로 막 기반의 항원에 대한 항체를 이용하여 살아있는 세포에서 직접 수행 할 수있다 (예를 들면. TRA-1-60, SSEA4) (12), 형광 특별히 배아 줄기 레이블을 알칼리 포스 파타 아제 (13) 또는 작은 분자를 감지하는 염료를보고 (들) 및 유도 만능 줄기 세포 (14). 그러나, 그럼에도 불구하고 항체는 세포에 악영향 각각 영향을 미칠 수있는 메트OD는 단일 다 능성 마커로 제한된다. 마지막으로, 형광 표지 분자는 살아있는 세포의 염색을 허용 헤어핀 구조, 듀얼 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 15을 설명 하였다. 이 접근법은 많은 유전자에 적용 할 수도 있지만, 기술은 성장 만능 콜로니에 해당되지 않는 단일 세포 현탁액의 nucleofection을 필요로한다.
몇 년 전에 유전자 특이 나노 입자는 인간 SKBR3 유방암 세포 (16)에 바이 빈 발현을 분석하기 위해 기술되었다. 이 원고는 금 나노 입자 복합체의 사용을 통해 라이브 ES 및 유도 만능 줄기 세포의 다 능성 마커를 감지하는 새로운 혁신적인 접근 방식을 설명합니다. 이러한 나노 입자는 상호 보완적인 RNA 서열과는 Cy3 표지 기자 가닥을 들고 결합 캡처 가닥 중앙 금 입자로 구성되어 있습니다. 기자 가닥의 형광 신호는 중앙 금 입자에 의해 급냉된다. 또한, 적절한나노 입자는 부정과 긍정적 인 컨트롤, 각각 (그림 1)을 제공하고 있습니다. (도 3) 애플리케이션에 대한 나노 입자는 단지 배지 (도 2)에 첨가하고, 엔도 사이토 시스를 통해 세포를 입력한다. 표적 RNA 발현되는 경우 그 다음 형광 신호를 발생 리포터 가닥 변위. 이 방법은 표적 세포 및 표적 유전자의 발현의 조작 생균 직접 형광 현미경 하에서 광학적으로 모니터링 될 수있는 필요로하지 않는다. 또한,이 기술은 IPS 세포의 경우 종간 원하는 표적 유전자에 적용 할 수 있고, 따라서 다양한 연구 분야에 사용될 수있다. 마지막으로, 유세포는 Cy3에 양성 세포의 식별 및 농축을 허용 분석한다.
본 작업은 직접 형광 현미경 하에서 다양한 histogenetic 원점과 다른 포유 동물 종으로부터의 생균의 세포 내 유전자 발현의 신뢰성을 평가할 수 형광 표지 된 나노 입자의 용도를 설명한다. 이 방법은 다른 게시 된 방법에 비해 몇 가지 장점이있다. 모든 연구원의 제는 표적 유전자 또는 세포 유형 중 하나에 대해 제한되지 않는다. 모든 항체 기초 검출 방법은 단일 에피토프에 한정되어있다. 형광 분자 표지는 또한 유전자의 광범위한 스펙트럼을 위해 설계 될 수 있지만,이 방법은 셀 및 후속 nucleofection (15)의 분리를 필요로한다. 대조적으로, 유전자 특이 나노 입자의 응용은 능동적으로 세포 내 이입에 의해 나노 입자를 삼키기 타겟 셀의 어떤 조작을 필요로하지 않는다. 후속 계대 동안 금 입자가 서서히 세포를 남겨 downstrea 배양에 사용될 수있다M 실험.
그럼에도 불구하고, 기술은 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 일부 마커 인해 이러한 SSEA-1 또는 TRA-1-81 (20) 그들의 탄수화물 자연에 분명히 감지 할 수 없습니다. 현재, 나노 입자의 큰 배열은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 입자는 세포 실험에서 그 기능에 대한 사전 테스트되었습니다. 본 연구의 목적은 종의 경계에 걸쳐 사용할 수있는 사용자 정의 프로브를 설계하는 것이 었습니다. 신규 표적 유전자 하나 프로브를 설계 할 때와 같은 방식에 따라 또는 경우에 실리의 기능을 프로브가 시험 관내에서 충분히 평가 될 필요가 있다고 예측 알아야한다. NANOG-SF1 한 쥐에서 일치하지 않는베이스와 돼지의 순서로 좋은 형광 신호를 생성하는 동안 서열 상 동성에 100 %의 상 동성을 보였다 NANOG-SF3 프로브는 전혀 작동하지 않았다. 또 다른 질문은 나노 입자의 효율적인 흡수를 의미한다. 입자는 입력엔도 시토 시스, 나노 입자 (21)의 크기에 의해 영향을 프로세스에 의해 세포, 세포 형 및 분화 상태 (22) 및 셀룰러 phago- 기능을 수행하고 23 macropinocytosis한다. 만족하는 형광 신호를 얻을 수 있도록 최적의 농도는 각각의 개별 애플리케이션 또는 세포주에 대해 시험 할 수있다. 이를 위해 첫 번째 실험은 항상 대상별하는 유전자 발현의 검출을 이동하기 전에 세포 종류와 배양 조건 내의 프로브의 적합성을 평가하기 흡수 제어 애플리케이션이 될 것이다.
신규 한 세포주에이 프로토콜을 적용하거나 세포 집단이 적당한 컨트롤 포함 때 중요한 포인트가 신뢰할 수있는 결과를 얻었다. 이제까지의 형광을 흡수 제어는 나노 입자의 농도가 표적 세포 집단에서 충분한 형광 신호를 유도 할 것이다 힌트를 제공 할 것이다. 형광 평가해야D 신호로 다음날 시간 17 사라질 것이다. 동시에 동일한 농도로 적용 진핵 게놈 대응없이 스크램블 제어 무시할 배경 신호를 유도한다. 제 3 제어로는 하우스 키핑 유전자의 특정 나노 입자 (예를 들어, GAPDH, β-액틴)를 사용하는 것이 좋습니다. 이들 나노 입자는 접근이 선택된 대상 세포 집단에서 특정 유전자의 발현을 검출하는데 사용될 수 양성 대조군으로 작용한다. 이러한 컨트롤이 판명되면 만족 한 다른 표적 유전자에 대한 특정 나노 입자를 사용하여 신뢰할 수있는 특정 형광 신호를 얻을 것으로 예상 할 수있다. 이들이 표적 서열 24를 하향 조절하는 것으로 나타났다로서 적용하는 나노 입자의 농도는 중요 할 수있다. 그러나,이 효과는 여기 (400 PM) 제시된 실험에 사용 된 농도보다 훨씬 높은 농도 (nM 내지 5)를 필요로한다. 이 농도 nanofla에서입술은 표적 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준 및 HEK293 및 뮤린 ES 세포 (17)의 증식을 저해하지 않는가 2nm만큼 높은 농도에 영향을 미치지 않는다. 또한, 전체 게놈 발현 분석, 유전자 발현의 25 현저한 변화를 보여주지 않았다. 따라서, 1 nm의 최대 농도에서 nanoflares은 중요한 부작용을 나타내지한다.
이 기술의 매우 유망한 응용 프로그램은 특정 유전자에 의해 표시되는 특정 세포 인구 레이블을 할 수있는 가능성이다. 최근, 유전자 특이 나노 입자가 성공적으로 선택적 라이브 심실 근세포 26 흑색 종 세포 (27)의 소집단 얼룩이 사용되고, 28 및 소뇌 세포 배양 29 단핵구. 이러한 형광 표시 세포 집단을 분류하고 생균 유동 세포 계측법에 의해 정제 할 수있다. 종양학 분야에서는 동물 모델에서 살아있는 전이성 종양 세포를 분리 상상할CEA의 발현, 유전자 또는 대상 구조를 촉진 가능성 전이의 검색을위한 가장 중요한 기준으로합니다. 최근 우리는 진정으로 재 프로그램 뮤린 만능 콜로니 검출 형광 강도 (17)에 기초하여 특이 Nanog를 반응계에서 나노 입자로 식별 될 수 있음을 보여 주었다. 따라서, 진정으로 재 프로그래밍 만능 줄기 식민지의 식별은 가장 유망한 식민지를 식별하기 위해 로봇 형광 검출 따기 장치를 사용하는 높은 처리량 플랫폼에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 특정 세포의 소집단을 선택하기 위해 많은 연구 분야에 적합한 것으로 나타나고는 높은 처리량 플랫폼에 나노 입자를 적용하는 것이 가능 보인다. 결론적으로,이 프로토콜은 생균 직접 세포 내 유전자 발현의 검출을 허용 형광 표지 된 나노 입자를 사용하는 신규 한 방법을 나타낸다. 이 기술은, 정화 확장하는 유용한 도구와 다른 특징이 될 수있다많은 연구 분야에서 드문 세포 개체군을이지는.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |