This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
בשנת 2006, גישה חדשנית תוארה לתכנת מחדש תאים סומטיים למצב pluripotent. לאחר prescreening של מערך של תכנות מחדש פוטנציאל גורמי fibroblasts עכברי יכולים להיות מומר בהצלחה למה שנקרא בתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) על ידי התמרה וביטוי יתר של ארבעה גורמי שעתוק retroviral (Oct4, Sox2, Klf4, ג-Myc) 1. בהמשך טכניקה זו יעילה שוחזרה באמצעות תאים סומטיים של מיני יונקים שונים כולל בני אדם 2, 3 קופים, חולדות 4, 5 כלבים, כבשים וחזירים 6 7. בנוסף, שונו השמטת פרוטוקולים או החלפת גורם שעתוק הפוטנציאלי שעור C- MYC פורסמו 8, 9.
ללא קשר לתכנות מחדש הראשוני להתקרב pluripotency האמיתי של מושבות גדלו יש לקבל אישור, משימה מפרכת וזמן רב. חסרון עיקרישל רוב הניתוחים אלו הוא שהם לא יכולים להתבצע על תאי חיים. גורמי pluripotency הוקמו כגון Oct4, Sox2, NANOG או REX1 מייצגים גורמי שעתוק ממוקמים בגרעין וזיהוי שלהם דורש קיבוע של התאים לפני אימונוהיסטוכימיה או תמוגה תא לניתוח RT-PCR 10 -. 12 מכאן ואילך, תאים אלה הולכים לאיבוד לעתיד ניסויים הדורשים תרבויות לשכפל של כל מושבה.
לפיכך, טכנולוגיה לנתח pluripotency בתאים חיים רצויה מאוד. אכן יכולים להתבצע במספר גישות ישירות על תאי חיים באמצעות נוגדנים המכוונים נגד אנטיגנים המבוסס על קרום (למשל. TRA-1-60, SSEA4) 12, ניאון דיווחו צבעים כדי לזהות מולקולות phosphatase 13 או קטן אלקליין שדווקא תווית גזע עוברי (ES) ותאי iPS 14. עם זאת, הנוגדנים עשויים בכל זאת להשפיע לרעה על התאים וכל ספידOD מוגבל לסמן pluripotency יחיד. לבסוף, משואות מולקולריות ניאון, oligonucleotides הכפול antisense עם מבני סיכת ראש, המאפשרים צביעת חיות של תאים, תוארו 15. למרות שגישה זו עשויה להיות מיושמת על גנים רבים, הטכניקה דורשת nucleofection של השעיה תא בודדת, אשר אינה חל על מושבות iPS גוברת.
לפני כמה שנות חלקיקי גן ספציפי תוארו לנתח ביטוי Survivin בתאי סרטן השד האנושיים SKBR3 16. כתב יד זה מתאר גישה חדשנית לגילוי רומן סמני pluripotency בES החי ותאי iPS באמצעות ננו-חלקיקי זהב conjugates. חלקיקים אלה כוללים חלקיקי זהב מרכזיים עם גדיל ללכוד יחד נושא את רצף RNA המשלים וגדיל כתב שכותרתו Cy3. אות הניאון של גדיל הכתב הוא הרווה ידי חלקיקי הזהב המרכזיים. בנוסף, מתאיםחלקיקים לשמש בקרות שליליות וחיוביות כ, בהתאמה (איור 1). ליישום חלקיקים פשוט הוסיפו למדיום התרבות (איור 2) ולהזין את התאים באמצעות אנדוציטוזה (איור 3). אם RNA היעד מתבטא זה מחליף את גדיל הכתב אשר לאחר מכן פולט אות ניאון. שיטה זו אינה דורשת מניפולציה של תא המטרה והביטוי של גן המטרה יכולה להיות במעקב אופטי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות בתאים חיים. יתר על כן, הטכנולוגיה יכולה להיות מיושמת על כל גן מטרה רצוי בין מינים במקרה של תאי iPS וכך יכולה להיות מועסק בתחומי מחקר רבים ושונים. לבסוף, זרימת cytometric מנתח לאפשר זיהוי והעשרה של תאים חיוביים Cy3.
העבודה הנוכחית מתארת את השימוש בחלקיקי הקרינה שכותרת המאפשרים הערכה אמינה של ביטוי גנים תאיים ישירות בתאים חיים ממיני יונקים שונים עם מקור histogenetic מגוון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יש כמה יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו. קודם כל החוקר אינו מוגבל ביחס לאו גן המטרה או סוג התא. כל שיטות זיהוי הנוגדן המבוסס מוגבלות לאפיטופ יחיד. למרות שגם יכולות להיות מתוכננות משואות מולקולריות ניאון עבור קשת רחבה של גנים, שיטה זו דורשת הניתוק של תאים ולאחר מכן nucleofection 15. לעומת זאת, היישום של חלקיקי גן ספציפי אינו דורש כל מניפולציה של תא המטרה שבולע חלקיקים באופן פעיל על ידי אנדוציטוזה. במהלך passaging הבא חלקיקי הזהב לעזוב בהדרגה את התאים והתרבות יכולה לשמש בdownstreaניסויים מ '.
עם זאת, הטכנולוגיה גם עדיין יש כמה מגבלות. סמנים חלקם ברור שלא לזיהוי בשל אופיים הפחמימות כגון SSEA-1 או TRA-1-81 20. נכון לעכשיו, מערך גדול של חלקיקים הוא זמין באופן מסחרי. חלקיקים אלה שנבדקו מראש על הפונקציונליות שלהם בניסויים סלולריים. מטרת העבודה הנוכחית הייתה לתכנן בדיקות מותאמות אישית שניתן להשתמש בם מעבר לגבולות מינים. כאשר בעקבות גישה כזו או בעת תכנון בדיקה לאחד גן מטרת רומן צריך להיות מודע לכך שהפונקציונליות של סיליקון בחזה בדיקה צריכה להיות מוערכת באופן יסודי במבחנה. הבדיקה NANOG-SF3 אשר הראתה הומולוגיה 100% להומולוגיה ברצף לא עבדה בכל הזמן שNANOG-SF1 עם בסיס אחד תואם בעכברי ורצף חזירי מיוצר אות הקרינה נחמדה. שאלה נוספת מתייחסת לספיגה היעילה של חלקיקים. החלקיקים להיכנסהתאים על ידי אנדוציטוזה, תהליך שמושפע מהגודל של חלקיקים 21, סוג התא ומצב הבידול 22 והיכולת הסלולרית לבצע phago- וmacropinocytosis 23. הריכוז האופטימלי כדי להשיג אות הקרינה מספקת יש להיבדק עבור כל יישום בודד או שורת תאים. לשם כך, הניסוי הראשון תמיד צריך להיות היישום של שליטת הספיגה להעריך את התאימות של הבדיקות בסוגי התאים ותנאי תרבות לפני שעבר ליעד ספציפי זיהוי של ביטוי גנים.
נקודה קריטית להשגת תוצאות אמינות בעת החלת פרוטוקול זה לשורת תאי רומן או אוכלוסיית תא היא ההכללה של בקרות נאותות. שליטת הספיגה אי פעם שזורחת בתספק רמז שריכוזים של חלקיקים יגרמו אות ניאון מספיק באוכלוסיית תא המטרה. הקרינה יש להעריךד למחרת כאות לדעוך עם זמן 17. במקביל השליטה לטרוף בלי עמית בגנום אוקריוטים מיושמים בריכוז זהה חייבת לגרום לאות רקע זניחה. כביקורת שלישית מומלץ להשתמש ננו-חלקיקים ספציפיים לגן משק (למשל GAPDH, β-אקטין). חלקיקים אלה משמשים כביקורת חיובית שהגישה יכולה לשמש כדי לזהות ביטוי גנים ספציפי באוכלוסיית תא היעד שנבחרה. אם בקרות אלה להתברר משביע רצון אחד יכול לצפות לקבל אותות ניאון ספציפיים אמין באמצעות חלקיקים ספציפיים לגנים מטרה אחרים. הריכוז של חלקיקים להחיל יכול להיות גם קריטי כפי שהם הוכחו למטה להסדיר את רצף היעד 24. עם זאת, השפעה זו דורשת ריכוזים גבוהים בהרבה (5 ננומטר) מהריכוזים המשמשים בניסויים שהוצגו כאן (400 בערב). בריכוז זה nanoflaמיל אינו משפיע על mRNA גן המטרה או רמות חלבון וריכוזים גבוהים ככל 2 ננומטר אינו פוגע בהתרבות המהירה של תאי גזע עובריים HEK293 ועכבריים 17. בנוסף, ניתוח ביטוי הגנום כולו לא גילה כל שינוי משמעותי בביטוי גני 25. לכן, בריכוזים של עד 1 ננומטר nanoflares לא צריך להציג שום תופעות לוואי חשובות.
יישום מבטיח מאוד של טכנולוגיה זו הוא האפשרות לתייג כל אוכלוסיית תא נתון שמסומנת על ידי גן ספציפי. לאחרונה, חלקיקי גן ספציפי בהצלחה נעשו שימוש כדי להכתים סלקטיבי myocytes החי חדרית 26, תת-אוכלוסיות של תאים מלנומה 27, מונוציטים 28 ותא המוח הקטן תרבויות 29. ניתן למיין אוכלוסיות תאים מסומנים הקרינה כזו ומטוהרות על ידי cytometry זרימת תאי חיים כ. בתחום האונקולוגיה זה ניתן להעלות על הדעת לבודד תאי גידול גרורתי בשידור חי במודלים של בעלי חייםהמבוסס על ביטוים של CEA, היקר ביותר לחיפוש של גרורות פוטנציאל קידום גנים או מבני יעד. לאחרונה הראו כי ניתן לזהות מושבות iPS עכברית באמת לתכנות מחדש באתר עם חלקיקי -specific Nanog מבוססים על עוצמת הקרינה זוהתה 17. לכן, זיהוי של מושבות iPS באמת לתכנות מחדש יכול להתבצע על פלטפורמות תפוקה גבוהות, המשתמשות בזיהוי הקרינה רובוטית והתקנים לקטוף לזהות מושבות המבטיחות ביותר. טכנולוגיה זו נראית מתאימה בתחומי מחקר רבים כדי לבחור תת-אוכלוסיות ספציפיות סלולריות ונראה כי ניתן להחיל את חלקיקים בפלטפורמות תפוקה גבוהות. לסיכום, פרוטוקול זה מייצג גישה חדשנית באמצעות חלקיקי הקרינה שכותרת המאפשר זיהוי של ביטוי גנים תאיים ישירות בתאים חיים. טכנולוגיה זו עשויה להיות כלי רב ערך כדי לטהר, להרחיב ואופי נוסףize תת-אוכלוסיות סלולריות נדירות בתחומי מחקר רבים.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |