This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
Em 2006, uma nova abordagem foi descrita para reprogramar células somáticas para um estado pluripotente. Depois prescreening de uma série de fatores de reprogramação potencial fibroblastos de murino pode ser convertido com êxito para as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) por transdução retroviral e superexpressão de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Posteriormente esta técnica efetivamente foi reproduzido com células somáticas de diferentes espécies de mamíferos, incluindo os seres humanos 2, 3 macacos, ratos, cães 4 5 6, ovelhas e porcos 7. Além disso, os protocolos modificado omitindo ou substituir o factor de transcrição de c-MYC potencialmente oncogénica foram publicados 8, 9.
Independentemente da reprogramação inicial aproximar o verdadeiro pluripotência das colónias em crescimento tem de ser confirmada, uma tarefa trabalhosa e demorada. Uma grande desvantagemda maioria destas análises é que eles não podem ser realizados em células vivas. Factores de pluripotência estabelecidos, tais como OCT4, SOX2, NANOG ou Rex1 representam factores de transcrição localizados no núcleo e a sua detecção requer a fixação das células antes da sua imuno-histoquímica ou a lise das células por análise de RT-PCR 10 -. 12 Em seguida, estas células são perdidas para futuro experimentos que requerem culturas réplica de cada colônia.
Assim, uma tecnologia para analisar pluripotência em células vivas é altamente desejável. Várias abordagens podem, efectivamente, ser realizada diretamente sobre as células vivas utilizando anticorpos dirigidos contra antigénios de membrana à base (por exemplo. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente relatado corantes para detectar 13 ou fosfatase alcalina moléculas pequenas que etiqueta especificamente estaminais embrionárias (ES) e células iPS 14. No entanto, os anticorpos podem, no entanto, afetar negativamente as células e cada methOD é restrito a um único marcador pluripotência. Finalmente, beacons moleculares fluorescentes, os oligonucleótidos anti-sentido com dupla-estruturas em gancho de cabelo, que permitem coloração vivo de células, têm sido descritos 15. Embora esta abordagem pode ser aplicada a muitos genes, a técnica requer nucleofection de uma suspensão de células individuais, que não é aplicável às crescentes iPS colónias.
Um par de anos atrás nanopartículas específicos do gene têm sido descritas para analisar a expressão de survivina em células de câncer de mama SKBR3 humanos 16. Este manuscrito descreve uma abordagem inovadora romance para detectar marcadores de pluripotência em ES vivos e células iPS através da utilização de conjugados de nanopartículas de ouro. Estas nanopartículas consistem de um centro de partículas de ouro com uma mecha de captura acoplados transportando a sequência de ARN complementar e um fio repórter marcado com Cy3. O sinal de fluorescência do fio repórter é extinta pela partícula de ouro central. Além disso, adequadonanopartículas servem como controlos negativos e positivos, respectivamente (Figura 1). Para uma aplicação das nanopartículas são simplesmente adicionados ao meio de cultura (Figura 2) e entram nas células através de endocitose (Figura 3). Se o RNA alvo é expresso que desloca a cadeia repórter que, em seguida, emite-se um sinal fluorescente. Este método não requer manipulação da célula alvo e a expressão do gene alvo pode ser monitorizado opticamente sob um microscópio de fluorescência directamente em células vivas. Além disso, a tecnologia pode ser aplicada a qualquer gene alvo desejado entre espécies no caso de células iPS e, assim, podem ser empregues em muitas áreas de investigação diferentes. Finalmente, análises de citometria de fluxo permite a identificação e o enriquecimento de células positivas Cy3.
O presente trabalho descreve a utilização de fluorescência marcado nanopartículas que permitem a avaliação fiável da expressão do gene intracelular directamente em células vivas a partir de diferentes espécies de mamíferos com origem diversa histogenética sob um microscópio de fluorescência. Esta abordagem tem uma série de vantagens em comparação com outros métodos publicados. Em primeiro lugar o pesquisador não está limitado no que respeita quer o gene alvo ou tipo de célula. Todos os métodos de detecção de anticorpos com base estão restritos a um único epítopo. Embora balizas moleculares fluorescentes podem também ser concebidos para uma ampla gama de genes, este método requer a dissociação das células e subsequente nucleofection 15. Em contraste, a aplicação de nanopartículas específicos do gene não necessita de qualquer manipulação da célula alvo que engole as nanopartículas activamente por endocitose. Durante a passagem em subsequente as partículas de ouro gradualmente deixar as células e a cultura pode ser utilizado em downstream experimentos.
No entanto, a tecnologia ainda também tem algumas limitações. Alguns marcadores não são obviamente detectável devido à sua natureza de hidrato de carbono, tais como SSEA-1 ou TRA-1-81 20. Actualmente, uma grande variedade de nanopartículas está disponível comercialmente. Estas partículas foram pré-testados para a sua funcionalidade nas experiências celulares. O objetivo do presente trabalho foi a concepção de sondas personalizadas que podem ser usados em toda espécie fronteiras. Ao seguir essa abordagem ou ao projetar uma sonda para uma novela um gene-alvo tem que estar ciente de que a funcionalidade de um in silico previu sonda precisa de ser cuidadosamente avaliada in vitro. A sonda NANOG-SF3 que mostrou 100% de homologia com a homologia de sequência não funciona em todos, enquanto NANOG-SF1 com uma base de descasados no murino e sequência de suíno produzido um sinal de fluorescência agradável. Outra questão refere-se à captação eficiente das nanopartículas. As partículas entraras células por endocitose, um processo que é influenciado pelo tamanho das nanopartículas 21, o tipo de célula e do estado de diferenciação 22, e a capacidade celular para realizar a phago- macropinocitose e 23. A concentração óptima para obter um sinal de fluorescência satisfatório tem de ser testado para cada aplicação individual ou linha de células. Para esse fim, o primeiro ensaio, devem sempre ser a aplicação de controlo da absorção de avaliar a compatibilidade das sondas dentro dos tipos de células e condições de cultura antes de passar para a detecção alvo específica da expressão do gene.
Um ponto crítico para se obter resultados confiáveis quando se aplica este protocolo para uma linha celular romance ou população de células é a inclusão de controles adequados. O controle de absorção fluorescente nunca irá fornecer uma sugestão de que as concentrações de nanopartículas irá induzir um sinal de fluorescência suficiente na população de células alvo. A fluorescência deve ser avaliard o próximo dia como o sinal vai desaparecer com o tempo 17. Ao mesmo tempo, o controlo de precipitação sem um homólogo no genoma eucariota aplicadas numa concentração idêntica deve induzir um sinal de fundo negligenciável. Como um terceiro controlo, é aconselhável usar uma nanopartícula específica para um gene de manutenção (por exemplo, de GAPDH, β-actina). Estas nanopartículas servir como um controlo positivo que a abordagem pode ser utilizada para detectar a expressão de genes específicos na população de células alvo seleccionada. Se esses controles acabam por um satisfatório pode esperar para obter sinais fluorescentes específicos confiáveis usando nanopartículas específicas para outros genes-alvo. A concentração das nanopartículas podem também ser aplicados como crítico que foram mostrados para regular negativamente a sequência alvo 24. No entanto, este efeito requer concentrações muito mais elevadas (5 nM) do que as concentrações utilizadas nas experiências aqui (400 pM) apresentados. A esta concentração o nanoflares não afectam ARNm do gene alvo ou os níveis de proteína e as concentrações tão elevadas como 2 nM não prejudicam a proliferação de células HEK293 e células ES murinas 17. Além disso, uma análise da expressão do genoma inteiro não revelaram quaisquer alterações significativas na expressão do gene 25. Portanto, a concentrações de 1 nM até os nanoflares não deve apresentar quaisquer efeitos adversos importantes.
Uma aplicação muito promissora desta tecnologia é a possibilidade de marcar qualquer população celular dado que é marcada por um gene específico. Recentemente, nanopartículas específicos do gene têm sido usados com sucesso para corar seletivamente miócitos ventriculares ao vivo 26, subpopulações de células de melanoma 27, monócitos e células 28 cerebelar culturas 29. Tais populações de células marcadas por fluorescência, pode ser ordenada e purificou-se por citometria de fluxo como células vivas. No campo da oncologia é imaginável para isolar células tumorais metastáticas vivo em modelos animaiscom base na sua expressão de CEA, mais valiosa para a pesquisa do potencial de metástase promover genes ou estruturas-alvo. Mostrámos recentemente que verdadeiramente reprogramadas iPS colónias murinas podem ser identificados in situ com nanog nanopartículas espec�icos com base na intensidade de fluorescência detectada 17. Portanto, a identificação de colónias iPS verdadeiramente reprogramadas poderia ser realizada em plataformas de alto rendimento, que utilizam detecção de fluorescência robotizada apanha e dispositivos para identificar as colónias mais promissores. Esta tecnologia parece ser adequado em muitas áreas de investigação para seleccionar subpopulações celulares específicas e parece possível aplicar as nanopartículas em plataformas rendimento elevados. Em conclusão, este protocolo representa uma nova abordagem de fluorescência utilizando nanopartículas marcado que permite a detecção da expressão do gene intracelular directamente em células vivas. Esta tecnologia pode ser uma ferramenta valiosa para purificar, expandir e mais personagemize subpopulações celulares raras em muitas áreas de investigação.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |