This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.
The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.
In 2006 werd een nieuwe benadering beschreven somatische cellen te herprogrammeren in een pluripotente toestand. Na prescreening een keus van herprogrammering factoren murine fibroblasten met succes kon worden omgezet in zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) door retrovirale transductie en overexpressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Vervolgens deze techniek effectief gereproduceerd met somatische cellen van verschillende zoogdiersoorten waaronder mensen 2, 3 apen, ratten 4, 5 honden, schapen en varkens 6 7. Bovendien, bewerkt protocollen weglaten of vervangen van de potentieel oncogene transcriptiefactor c-MYC gepubliceerd 8, 9.
Ongeacht de initiële herprogrammering benaderen ware pluripotentie van groeiende kolonies moet bevestigd, een moeizame en tijdrovende taak. Een belangrijk nadeelde meeste van deze analyses is dat ze niet kunnen worden uitgevoerd op levende cellen. Gevestigde pluripotentie factoren zoals OCT4, SOX2, NANOG of REX1 vertegenwoordigen transcriptiefactoren in de kern en de detectie vereist fixatie van de cellen voorafgaand aan immunohistochemie of cellysis voor RT-PCR analyse 10 -. 12 Daarna worden deze cellen verloren toekomst experimenten die vermenig- van elke kolonie.
Dus een technologie om pluripotentie analyseren levende cellen is zeer gewenst. Verschillende benaderingen kunnen inderdaad direct worden uitgevoerd op levende cellen met behulp van antilichamen gericht tegen membraan-gebaseerde antigenen (bv. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente kleurstoffen gemeld aan alkalische fosfatase of 13 kleine moleculen die specifiek label embryonale stamcellen detecteren (ES) en iPS-cellen 14. Echter, kunnen de antilichamen wel negatieve invloed op de cellen en elke method beperkt tot één pluripotentie marker. Tenslotte fluorescerende moleculaire beacons, dual-antisense oligonucleotiden met haarspeldstructuren die levende kleuring van cellen mogelijk maken, zijn beschreven 15. Hoewel deze benadering kan worden toegepast op vele genen, de techniek vereist nucleofection van een celsuspensie, die niet van toepassing op groeiende iPS kolonies.
Een paar jaar geleden gen-specifieke nanodeeltjes zijn beschreven survivin expressie te analyseren in menselijke SKBR3 borstkankercellen 16. Dit manuscript beschrijft een nieuwe innovatieve aanpak van het opsporen van pluripotentie markers in levende ES en iPS-cellen door het gebruik van goud nanodeeltjes conjugaten. Deze nanodeeltjes bestaan uit een centrale goud deeltje met een gekoppelde capture streng die de complementaire RNA-sequentie en een Cy3-gemerkte reporter streng. Het fluorescentiesignaal van de reporter streng wordt afgeschrikt door de centrale gouddeeltje. Daarnaast geschiktenanodeeltjes dienen als negatieve en positieve controles, respectievelijk (figuur 1). Voor een toepassing van de nanodeeltjes zijn gewoon toegevoegd aan het kweekmedium (figuur 2) en voer de cellen via endocytose (figuur 3). Als het doel RNA uitdrukte verdringt de verslaggever streng die vervolgens zendt een fluorescent signaal. Deze methode vereist geen manipulatie van de doelcel en de expressie van het doelwitgen kan optisch worden bewaakt onder een fluorescentiemicroscoop direct in levende cellen. Bovendien kan de technologie worden toegepast op elk gewenst doelgen alle species bij iPS cellen en kan dus worden toegepast op verschillende onderzoeksgebieden. Tot slot, flowcytometrische analyse laat de identificatie en de verrijking van Cy3 positieve cellen.
Het huidige werk beschrijft het gebruik van fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes die de betrouwbare evaluatie van intracellulaire genexpressie mogelijk maken direct in levende cellen van andere zoogdierspecies met diverse histogenetic oorsprong onder een fluorescentiemicroscoop. Deze benadering heeft een aantal voordelen vergeleken met andere gepubliceerde methoden. Allereerst de onderzoeker niet beperkt met betrekking tot zowel het doelgen of celtype. Alle antilichamen gebaseerde detectiemethoden worden beperkt tot een enkele epitoop. Hoewel fluorescerende moleculaire beacons kunnen ook worden ontworpen voor een breed spectrum van genen vereist deze werkwijze de dissociatie van de cellen en latere nucleofection 15. In tegenstelling, is de toepassing van gen-specifieke nanodeeltjes geen manipulatie van het doel cel die de nanodeeltjes overspoelt actief door endocytose nodig. Tijdens de daarop volgende passage gouddeeltjes geleidelijk laat de cellen en de cultuur kan worden gebruikt in downstream experimenten.
Toch is de technologie ook nog enige beperkingen. Enkele markers zijn uiteraard niet detecteerbaar door hun aard koolhydraat zoals SSEA-1 en TRA-1-81 20. Momenteel wordt een groot scala aan nanodeeltjes in de handel verkrijgbaar. Deze deeltjes werden vooraf getest op hun functionaliteit in cellulaire experimenten. Het doel van dit werk was om aangepaste probes die kunnen worden gebruikt in soorten grenzen te ontwerpen. Bij het volgen van een dergelijke aanpak of bij het ontwerpen van een sonde voor een nieuw target-gen moet men er rekening mee dat de functionaliteit van een in silico voorspelde sonde moet grondig worden geëvalueerd in vitro. De NANOG-SF3 sonde, die een 100% homologie bleek de sequentiehomologie werkte niet helemaal terwijl NANOG-SF1 met een niet passende basis in de muizen en varkens sequentie produceerde een mooie fluorescentie signaal. Een andere vraag heeft betrekking op de efficiënte opname van de nanodeeltjes. De deeltjes in te voerende cellen door endocytose, een proces dat wordt beïnvloed door de grootte van de nanodeeltjes 21, het celtype en de differentiatiestatus 22 en het cellulaire vermogen om phago- voeren en macropinocytose 23. De optimale concentratie van een bevredigende fluorescentiesignaal verkregen worden getest voor elke toepassing of cellijn. Daartoe moet het eerste experiment altijd de toepassing van de opname controle op de verenigbaarheid van de sondes in de cel typen en cultuur te evalueren alvorens over te gaan richten op specifieke detectie van genexpressie zijn.
Een kritisch punt om betrouwbare resultaten te verkrijgen bij toepassing van dit protocol op een nieuwe cellijn of celpopulatie is de opname van passende controles. De steeds fluorescerende opname besturing een hint waar de concentraties van nanodeeltjes voldoende fluorescerend signaal in de doelcel populatie induceert verschaffen. De fluorescentie moeten evaluerend de volgende dag als het signaal zal vervagen met de tijd 17. Tegelijkertijd de scramble controle zonder tegenhanger in het eukaryote genoom aangebracht in dezelfde concentratie verwaarloosbaar achtergrondsignaal moeten induceren. Als derde controle is het raadzaam om een nanodeeltje specifiek voor een huishoud-gen (bijv GAPDH, β-actine) gebruikt. Deze nanodeeltjes dienen als een positieve controle die de benadering kan worden gebruikt om genexpressie te detecteren in het gekozen doelwitcelpopulatie. Als deze controles blijken bevredigende men kan verwachten om betrouwbare specifieke fluorescente signalen te krijgen met behulp van nanodeeltjes die specifiek zijn voor andere doelgroepen genen. De concentratie van de toegepaste nanodeeltjes kunnen eveneens kritisch omdat zij bleken down-reguleren van de doelsequentie 24. Dit effect vergt veel hogere concentraties (5 nM) dan de concentraties die in de experimenten here (400 pM) voorgesteld. Bij deze concentratie verschafte de nanoflares hebben geen invloed doelwit-gen mRNA of eiwit niveau en de concentraties zo hoog als 2 nM hebben de proliferatie van HEK293 en muizen ES-cellen 17 niet aantasten. Bovendien heeft een hele genoom expressie analyse geen significante veranderingen in genexpressie 25 onthullen. Daarom, bij concentraties tot 1 nM de nanoflares mag geen Negatieve effecten vertonen.
Een veelbelovende toepassing van deze technologie is de mogelijkheid om een bepaalde celpopulatie die wordt gekenmerkt door een specifiek gen label. Recent zijn genspecifieke nanodeeltjes succes gebruikt om selectief vlek levende hartspiercellen 26, subpopulaties van melanoomcellen 27, monocyten 28 en cerebellaire celculturen 29. Dergelijke fluorescentie gemarkeerde celpopulaties kunnen worden gesorteerd en gezuiverd met flowcytometrie als levende cellen. Op het gebied van oncologie is het denkbaar om levende uitgezaaide tumorcellen in diermodellen isolerenop basis van hun expressie van CEA, waardevolste zoekterm mogelijke metastase bevorderen genen of doelstructuren. We hebben onlangs aangetoond dat werkelijk geprogrammeerd muizen iPS kolonies kunnen worden geïdentificeerd in situ met Nanog -specifieke nanodeeltjes op basis van de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit 17. Derhalve kan de identificatie van waarlijk geherprogrammeerd iPS kolonies worden uitgevoerd op hoge doorvoer platforms, die robotachtige fluorescentiedetectie plukken en apparaten om de meest veelbelovende kolonies te identificeren. Deze techniek lijkt geschikt te zijn in veel onderzoeksgebieden specifieke cellulaire subpopulaties selecteren en lijkt het mogelijk om de nanodeeltjes passen in high throughput platformen. Tot slot, dit protocol staat voor een nieuwe benadering met behulp van fluorescentie gelabelde nanodeeltjes die in levende cellen de detectie van intracellulaire genexpressie mogelijk maakt direct. Deze technologie kan een waardevol instrument om te zuiveren, uit te breiden en verder karakterize zeldzame cellulaire subpopulaties in veel onderzoeksgebieden.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |