El reclutamiento de leucocitos en el hígado se produce dentro de los canales especializados de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas únicas. Microscopía de contraste de fase de reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano en condiciones de tensión de cizallamiento fisiológica puede facilitar la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso.
La infiltración de leucocitos en el tejido de hígado humano es un proceso común en todas las enfermedades inflamatorias del hígado adultas. Infiltración crónica puede conducir al desarrollo de la fibrosis y la progresión a cirrosis. La comprensión de los mecanismos moleculares que median el reclutamiento de leucocitos hacia el hígado podría identificar dianas terapéuticas importantes para la enfermedad hepática. La interacción clave durante el reclutamiento de leucocitos es la de las células inflamatorias con endotelio en condiciones de estrés de cizallamiento. El reclutamiento para el hígado se produce dentro de los canales de cizallamiento bajas de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas (HSEC). Las condiciones dentro de los sinusoides hepáticos pueden recapitulan perfundiendo leucocitos a través de canales revestidos por monocapas HSEC humanos con caudales específicos. En estas condiciones leucocitos se someten a un breve paso inmovilización seguido por la activación y adhesión firme, seguido de una etapa de rastreo y la posterior transmigración a través de la endotelialcapa. Usando microscopía de contraste de fases, cada paso de este "cascada de adhesión" se puede visualizar y grabó seguido de análisis fuera de línea. Las células endoteliales o los leucocitos pueden ser tratados previamente con inhibidores para determinar el papel de las moléculas específicas durante este proceso.
Está bien establecido que el reclutamiento de leucocitos en general sigue el paradigma de la cascada de adhesión de varios pasos 1. Esto implica la captura de leucocitos de la sangre que fluye por las células endoteliales que recubren la pared del vaso. Inicialmente, los leucocitos se someten a una etapa de laminación que está mediada por selectina o los receptores de los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Esto permite que los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) expresados en la superficie de leucocitos para ser activados por quimiocinas presentados en el glicocálix endotelial. Esto conduce a la alteración de la confirmación de la integrina a un estado de "alta afinidad" en la superficie de leucocitos y el arresto y la firma de adhesión al endotelio. Adherencia firme es seguido por un cambio de forma y de rastreo del leucocito en el buque. El paso final es la transmigración a través de la monocapa endotelial, que puede ocurrir a través de paracelular o transcelular rutas.
Mientras que la cascada de adhesión de varios pasos describirs el mecanismo general de reclutamiento de leucocitos en el cuerpo hay diferencias específicas de órganos. En el hígado la mayoría de reclutamiento de leucocitos se produce dentro de los sinusoides hepáticos en contraste con otros órganos donde el reclutamiento generalmente se produce dentro de las vénulas post-capilares 2. Los sinusoides hepáticos son un entorno de baja cizalladura y leucocitos sufren un breve paso tethering con anterioridad a la adhesión firme que se selectina independiente 2. Estos canales están revestidos por el endotelio sinusoidal hepático que es discontinua y contiene fenestras, poros abiertos 100-200 nm de diámetro, y carecen de una membrana basal 3. Elucidar los mecanismos moleculares que median el reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano podría identificar de órganos dianas terapéuticas específicas para las enfermedades inflamatorias del hígado.
Ensayos de adhesión de flujo son herramientas esenciales en el estudio de reclutamiento de leucocitos. Ellos permiten la reconstrucción de recru leucocitositment en presencia de la tensión de cizallamiento para analizar la adherencia bajo fuerzas bien definidos. El uso más frecuente para el ensayo es la adherencia de leucocitos estudio a monocapas endoteliales cultivadas o sustratos purificados. Cámaras de flujo comercialmente disponibles se utilizan para perfundir células bajo condiciones de flujo laminar entre dos superficies planas y luego visualizar el proceso dinámico de la adhesión en un microscopio 4. Grupos anteriores han demostrado que ciertas interacciones adhesivas sólo tienen lugar bajo flujo y no pueden ser estudiados en ensayos estáticos 5,6.
Hemos utilizado esta técnica para recapitular los sinusoides hepáticos y estudiar el reclutamiento de leucocitos en condiciones de baja tensión de cizallamiento. HSEC humana primarios se cultivaron en microportaobjetos y leucocitos puede entonces ser perfundido más de esta monocapa a una velocidad de flujo calculado para reproducir el esfuerzo cortante dentro de los sinusoides hepáticos. La tensión de cizallamiento es una tensión que se aplica en paralelo o tangencial a una superficie como OPPosed al estrés normal, que es perpendicular. Cualquier líquido que se mueve a lo largo de una frontera ejercerá una tensión de corte en esa frontera. El esfuerzo cortante ha demostrado ser un componente esencial de la transmigración de linfocitos 7. En estas condiciones, cada paso de la cascada de adhesión puede ser visualizada por microscopía de contraste de fase. Este método ha permitido importantes conocimientos sobre el reclutamiento de leucocitos dentro del hígado incluyendo el estudio de moléculas de adhesión convencionales 8, el papel de las quimioquinas y receptores de quimioquinas 9-11, y moléculas de adhesión atípicos tales como la proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1 ) 8,12 y linfática común y endotelial vascular receptor-1 (Clever-1) 13. Mientras que este ensayo ha sido mencionado en varias de las publicaciones de nuestro Grupo, su descripción ha sido breve y hemos aprovechado esta oportunidad para ofrecer un detallado paso a paso guía para ayudar en la solución de problemas y prevenir errores técnicos cuando intentoción del ensayo. Además, se ha cambiado recientemente la compra de componentes de las cámaras MicroSlide que permite modificaciones precisas en el estrés de cizalla. Creemos que esto amplía la aplicabilidad del ensayo a otras células endoteliales e inmunes. El siguiente método describe la preparación y la técnica para llevar a cabo un ensayo de adherencia basado en el flujo con células sinusoidales hepáticas humanas endoteliales y linfocitos de sangre periférica.
El paso más crítico para llevar a cabo con éxito un ensayo de flujo es asegurar que una monocapa sana y confluente de células endoteliales está listo antes de que el ensayo de adhesión de flujo. Células endoteliales primarias pueden ser difíciles de cultivar y sensibles a las alteraciones en los métodos de cultivo. Es importante que 1) cámaras de flujo están de manera adecuada y uniformemente recubiertas con células endoteliales en una monocapa; para HSEC usamos rata colágeno de tipo I, pero esta cola pueden ser diferentes para otras poblaciones endoteliales, 2) medio de cultivo es adecuado para el tipo de célula, para HSEC hemos descrito nuestro medio completo en la sección de protocolo. Otros pasos vitales incluyen el establecimiento de la bomba de jeringa a la velocidad apropiada para reflejar los niveles fisiológicos de esfuerzo de corte.
Durante el ensayo de flujo es necesario para evitar burbujas de aire dentro del circuito de flujo que puede dañar la monocapa endotelial o de tiras de las células inmunes de la superficie endotelial. Esto se puede evitar por la norma ENsuring que todos los tubos y adaptadores de silicona son perfundidos con tampón de lavado antes de la conexión, que todas las burbujas de aire se eliminan y los medios de comunicación que se precalentaron antes de su uso. Al conectar los adaptadores a los puertos en el MicroSlide es muy importante que haya una interfaz de líquido / líquido durante la conexión, si hay alguna aire entonces esto va a formar un espacio de aire dentro del sistema que perturbar la monocapa endotelial durante la retirada de la jeringa paso. La solución de leucocitos en el cuerpo de la jeringa necesita agitación regular para asegurar que las células no se establecen, manteniendo así una densidad celular constante durante todo el experimento.
Durante los pasos de grabación que es importante para garantizar que la imagen de la capa endotelial está adecuadamente enfocada y clara para permitir el análisis fuera de línea precisa, y que durante la segunda etapa del ensayo de flujo (mensaje de leucocitos en bolo) se deja que el tiempo suficiente durante el tampón de lavado fase antes de la grabación se reanudó para asegurar quese eliminan todos los leucocitos adherentes. Del mismo modo es esencial utilizar las células endoteliales en una monocapa de densidad adecuada para evitar la pérdida de las células que pueden interferir con los patrones de flujo en los capilares estrechos y también puede ser difícil de diferenciar de leucocitos adherentes más grandes bajo microscopía de contraste de fase. Hemos descrito la densidad óptima de siembra para las células endoteliales sinusoidales hepáticas humanas, pero esto puede variar entre diferentes poblaciones y especies endoteliales.
Se han logrado avances significativos en el estudio de reclutamiento de leucocitos en modelos animales con microscopía intravital. La principal ventaja del método de ensayo de adhesión de flujo es que el reclutamiento de leucocitos puede ser estudiada en un sistema binario con células endoteliales humanas primarias. Además, estas interacciones pueden ser estudiados bajo niveles fisiológicos relevantes de la tensión de cizallamiento. Es importante para confirmar los resultados de los estudios en animales intravital con los sistemas celulares humanos ya que puede haber diferees en las propiedades endoteliales entre las especies. Una de las limitaciones del ensayo de flujo es que el reclutamiento de leucocitos se está estudiando en un entorno unicelular de la monocapa endotelial. Además una vez que los leucocitos se han adherido y transmigrado a través del endotelio que pueden no estar en presente en número suficiente para ser aislado y sometido a procesos posteriores.
A pesar de estas limitaciones, una vez que el ensayo de adhesión flujo se ha dominado, se puede desarrollar para llevar a cabo un análisis más detallado de la cascada de adhesión de leucocitos y adaptado para recapitular un entorno multicelular. Grabación prolongada de campos individuales y el uso de software de seguimiento se puede utilizar para analizar el comportamiento de rastreo de los leucocitos. Además al finalizar el ensayo de flujo de los micro-portaobjetos pueden ser interrogados mediante microscopía confocal de barrido láser y el etiquetado de inmunofluorescencia para estudiar la adhesión y la transmigración en más detalle. Además, hemos desarrollar previamenteed un modelo in vitro, donde los leucocitos que fluyen podrían interactuar con endotelio hepático condicionada por la presencia de hepatocitos. Este ensayo también puede ser desarrollado para estudiar las subpoblaciones de leucocitos: nuestro grupo ha realizado estudios con subconjuntos tales como células reguladoras T, células B, y leucocitos de hígado infiltrante.
Estos estudios son evidencia de que el ensayo de adhesión de flujo es una poderosa herramienta para estudiar el reclutamiento de leucocitos general y específica de órganos en los sistemas humanos.
The authors have nothing to disclose.
SS es financiado por una Beca Clínica Wellcome Trust Intermedio, CW por un Fiduciario del Programa de Beca Wellcome.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |