白细胞募集到肝脏发生这是由独特的肝窦内皮细胞衬里肝窦的专业渠道内。整个生理切应力条件下的人力肝窦内皮细胞白细胞招聘相衬显微镜可以促进其背后这一过程的分子机制的阐明。
白细胞浸润到人肝组织中所有成年肝脏炎性疾病的一个共同的过程。慢性浸润可以驱动纤维化进展的发展为肝硬化。了解介导白细胞募集到肝脏的分子机制可以识别肝脏疾病的重要治疗靶标。白细胞招募期间的关键相互作用是炎症细胞与剪切应力的条件下,内皮细胞。招聘到肝脏发生这是由肝窦内皮细胞(HSEC)内衬肝窦的低剪切通道内。肝窦内的条件可以通过在特定的流速内衬由人类HSEC单层通道灌注白细胞进行概括。在这些条件下的白细胞进行一个简短的圈养步骤和随后的激活和紧贴性,其次是跨内皮爬行一步,后续的轮回层。用相衬显微镜,这'粘附级联“的每一步骤,可以可视化并记录随后的离线分析。内皮细胞或白细胞可以预先用抑制剂,以确定特定的分子在此过程中的作用。
现在是公认的一般白细胞招聘如下多级级联的附着力1的范例。这涉及白细胞从血管内皮细胞衬里的容器壁流动的血液的采集。最初,白细胞经受这是由选择素受体或免疫球蛋白超家族的成员介导的一个轧制工序。这使得G-蛋白偶联受体(GPCRs)表达于白细胞表面由呈现在内皮糖萼的趋化因子被激活。这导致整确认的改动在白细胞表面的“高亲和力'的状态,并逮捕和牢固粘附于血管内皮细胞。随后是在容器上的白细胞的形态变化和爬行牢固粘连。最后的步骤是轮回穿过内皮细胞单层,其可以通过细胞旁或跨细胞途径发生。
而多级级联的附着力描述s白细胞招聘的身体内的一般机制有器官特异性差异。在肝脏中的大多数白细胞招募发生在相对 于其他器官,其中招募一般发生在毛细血管后微静脉2内肝窦内。肝窦是低剪切环境和白细胞进行坚定的附着力是选择素独立前2简要圈养的一步。这些通道是由肝窦内皮细胞是不连续的,并且包含窗孔,在直径开孔100-200nm的内衬,以及缺乏基底膜3。阐明介导白细胞招聘人力对面肝窦内皮细胞的分子机制,可以识别器官的炎症性肝脏疾病的具体治疗目标。
流动附着力试验正在研究白细胞招聘必不可少的工具。他们允许白细胞recru重建itment在剪应力分析下明确定义的粘附力的存在。最频繁使用的测定是研究白细胞粘附到培养的内皮单层的或纯化的底物。市售的流动室被用于灌注细胞两个平面之间的层流的条件下,然后显现粘合性的动态过程,在显微镜4。前面的组显示出,某些粘合剂的相互作用仅采取下流动的地方,无法在静态测定5,6研究。
我们已经用这种技术来概括肝窦和研究低剪切应力条件下白细胞招聘。初级人类HSEC在microslides和白细胞培养就可以在流量计算,肝窦内重现剪切应力的速度进行灌注在这个单层。的剪切应力是应用于平行或相切的面作为奥普一个应力osed正常应力相垂直。任何沿边界移动的流体将施加在该边界上的剪应力。剪切应力已被证明是淋巴细胞轮回7的基本组成部分。在这些条件下的粘附级联的每个步骤可通过相衬显微镜可观察到。这种方法已允许了重要的见解进入肝脏,包括研究常规粘附分子8,趋化因子和趋化因子受体9-11的作用,和非典型的粘附分子,如血管粘附蛋白-1(VAP-1内白细胞的募集)8,12和共同淋巴管和血管内皮受体-1(叻-1)13。虽然这个实验已经提到在我们几个组的出版物,它描述颇短,我们已经采取了这一机会,提供一步地指导了详细的步骤,以帮助故障诊断和预防技术错误时尝试ing的检测。此外,我们最近改变了microslide室的采购,它允许精确的改建剪切应力。我们相信,这拓宽了检测到其他内皮细胞和免疫细胞的适用性。下面的方法描述了制备和技术,用于执行与人类肝窦内皮细胞和外周血淋巴细胞的流程基于粘附实验。
为成功地执行流分析中最关键的步骤是确保内皮细胞的健康和汇合单层准备之前的流动粘附实验。初级内皮细胞可能很难培养,并在培养方法的改变很敏感。但重要的是1)流动室被充分且均匀地涂覆有内皮细胞的单层;为HSEC我们采用鼠尾I型胶原,但是这可能不同于其他内皮种群,2)培养基是适当的细胞类型,为HSEC我们在协议部分描述了我们完全培养基。其他重要的步骤包括设置注射泵以适当的比率来反映生理水平的剪切应力。
在流量测定,有必要防止流电路,它可以破坏内皮细胞单层或由内皮表面剥离的免疫细胞内的气泡。这可以通过连接被阻止suring所有的硅胶管和适配器灌注前连接洗涤缓冲液,所有的气泡被去除,并且在使用前媒体预热。当连接到适配器上的microslide这是很重要的,有连接过程中的液/液界面的端口,如果存在任何空气,那么这将形成系统,该系统将注射器抽出时破坏内皮细胞单层中的空气间隙一步。在注射器针筒的白细胞溶液需要定期搅动以确保该细胞不沉淀,从而保持恒定的细胞密度在整个实验。
在记录步骤,它保证了内皮细胞层的图像被适当地聚焦和清晰,以允许精确的离线分析是很重要的,并且在该流量测定法(后白细胞药团)的第二步骤中有足够的时间在洗涤缓冲液中左录制前阶段重新开始,以确保所有非贴壁白细胞被删除。同样地,必须使用内皮细胞中的适当密度的单层,以防止细胞可以在窄的毛细管流动模式干涉的损失,也可以是硬从相差显微镜下放大粘附白细胞区分。我们已经描述了最佳接种密度对人肝窦内皮细胞,但可能不同内皮种群和物种之间变化。
显著的进步已经取得了在研究招募白细胞在动物模型与活体显微镜。流粘附试验方法的主要优点是,白细胞招募可以在一个二进制系统与原代人内皮细胞进行研究。此外,这些相互作用可以根据剪应力的生理相关水平进行研究。它证实活体研究发现在动物与人类蜂窝系统是重要的,因为有可能是differencES在物种之间内皮属性。一项所述的流量测定的局限性在于,白细胞招募正在研究中的内皮单层的单细胞环境。此外,一旦白细胞已粘附和transmigrated跨内皮它们可能不存在足够数量的被分离并进行下游处理。
尽管有这些限制,一旦流动粘附实验已经掌握了它可以被开发来进行白细胞黏附级联的进一步分析和适应复述一个多细胞环境。单个字段以及使用跟踪软件的延长记录可以用来分析白细胞爬行行为。此外,该流分析完成后microslides可以使用激光扫描共聚焦显微术和免疫荧光标记,研究粘附和轮回中更详细地进行讯问。此外,我们先前开发编着的体外模型,其中流过的白细胞可与肝血管内皮细胞通过肝细胞的存在条件进行交互。此法也可开发研究白细胞亚群:我们集团已与子集,如调节性T细胞,B细胞和肝脏浸润的白细胞进行研究。
这些研究的证据表明,流动粘附实验是一个功能强大的工具来研究一般和器官特异性白细胞招聘人类系统。
The authors have nothing to disclose.
SS被资助由威康信托中级临床医学研究,顺时针由威康信托计划资助。
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |