Leucociti assunzioni al fegato avviene nei canali specializzati delle sinusoidi epatici che sono rivestite da cellule endoteliali sinusoidali epatiche uniche. Fase microscopio a contrasto di reclutamento dei leucociti attraverso l'endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di shear stress fisiologico può facilitare la delucidazione dei meccanismi molecolari che sono alla base di questo processo.
Leucocyte infiltrazione nel tessuto epatico umano è un processo comune a tutte le malattie epatiche infiammatorie adulti. Infiltrazione cronica può guidare lo sviluppo di fibrosi e la progressione a cirrosi. La comprensione dei meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti al fegato ha potuto identificare importanti bersagli terapeutici per le malattie del fegato. L'interazione tasto durante leucociti reclutamento è quella delle cellule infiammatorie con endotelio in condizioni di sforzo di taglio. Assunzioni al fegato si verifica entro le basse canali taglio delle sinusoidi epatici che sono allineati dalle cellule epatiche endoteliali sinusoidali (HSEC). Le condizioni all'interno dei sinusoidi epatici possono essere riepilogati mediante perfusione leucociti attraverso i canali fiancheggiati da monostrati HSEC umani a portate specifiche. In queste condizioni leucociti sottoposte ad un breve passo tethering seguita da attivazione e adesione stabile, seguita da una fase di scansione e successiva trasmigrazione di tutti i endotelialestrato. Utilizzando la microscopia a contrasto di fase, ogni passo di questa 'cascata adesione' può essere visualizzato e registrato seguita da analisi offline. Cellule endoteliali o leucociti possono essere pretrattate con inibitori per determinare il ruolo di molecole specifiche durante questo processo.
E 'ormai accertato che il reclutamento dei leucociti, in generale, segue il paradigma della cascata adesione multistep 1. Ciò comporta la cattura di leucociti dal sangue che scorre dalle cellule endoteliali che rivestono la parete del vaso. Inizialmente, leucociti subiscono una fase di laminazione che è mediata da recettori selectina o membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Questo permette recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) espressi sulla superficie dei leucociti essere attivata da chemochine presentate sul glicocalice endoteliale. Questo porta all'alterazione della conferma integrina ad uno stato 'alta affinità' sulla superficie dei leucociti e arrestare e ferma adesione all'endotelio. Ferma adesione è seguito da cambiamento di forma e scansione della leucocitaria sulla nave. Il passo finale è trasmigrazione attraverso il monostrato endoteliale, che può avvenire tramite paracellulare o transcellulare aeree.
Mentre la cascata adesione multistep descriveres il meccanismo generale di leucociti assunzioni all'interno del corpo ci sono differenze specifiche organo. Nel fegato la maggior parte dei leucociti assunzione avviene entro i sinusoidi epatici a differenza di altri organi dove il reclutamento avviene generalmente all'interno delle venule post-capillari 2. Le sinusoidi epatici sono un ambiente a basso taglio e leucociti sottoposte ad un breve passo tethering prima di consolidare l'adesione che è selectina indipendenti 2. Questi canali sono rivestite da endotelio sinusoidale epatica che è discontinuo e contiene Fenestrae, pori aperti 100-200 nm di diametro, e mancano di una membrana basale 3. Chiarire i meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti attraverso l'endotelio sinusoidale epatico umano potrebbe identificare organo specifici bersagli terapeutici per le malattie del fegato infiammatorie.
Saggi di adesione di flusso sono strumenti essenziali nello studio leucocitaria assunzioni. Essi consentono la ricostruzione di leucociti recruitment in presenza di shear stress per analizzare l'adesione in forze ben definite. L'uso più frequente per il saggio è lo studio dei leucociti adesione a monostrati endoteliali o substrati purificati. Camere di flusso commercialmente disponibili sono utilizzati per perfusione cellule in condizioni di flusso laminare tra due superfici piane e poi visualizzare il processo dinamico di adesione su un microscopio 4. Gruppi precedenti hanno dimostrato che alcune interazioni adesive avvengono solo sotto il flusso e non possono essere studiata in saggi statici 5,6.
Abbiamo utilizzato questa tecnica per ricapitolare i sinusoidi epatici e studiare il reclutamento dei leucociti in condizioni di bassa tensione di taglio. Primario HSEC umano sono coltivate in microslides e leucociti può essere perfuso su questo monostrato ad una velocità di portata calcolata di riprodurre lo sforzo di taglio entro sinusoidi epatici. Lo sforzo di taglio è una sollecitazione che viene applicata parallela o tangente ad una superficie come opposed a sforzo normale, che è perpendicolare. Qualsiasi fluido che si muove lungo un confine eserciterà una sollecitazione di taglio su quel confine. Shear stress ha dimostrato di essere una componente essenziale di linfociti trasmigrazione 7. In queste condizioni ogni passo della cascata adesione può essere visualizzato mediante microscopia a contrasto di fase. Questo metodo ha permesso importanti conoscenze sulla reclutamento di leucociti all'interno del fegato compreso lo studio di molecole di adesione convenzionali 8, il ruolo delle chemochine e recettori per chemochine 9-11, e molecole di adesione atipici quali l'adesione vascolare proteina-1 (VAP-1 ) 8,12 e linfatica e vascolare endoteliale comune recettore-1 (CLEVER-1) 13. Anche questo test è stato citato in diverse pubblicazioni del nostro gruppo, la sua descrizione è stata breve e ci hanno colto questa opportunità per fornire una dettagliata passo passo guida per aiutare nella risoluzione dei problemi e prevenire errori tecnici durante il tentativozione del test. Inoltre, abbiamo recentemente cambiato il reperimento delle camere MicroSlide che permette alterazioni accurati shear stress. Crediamo che questo allarga l'applicabilità del test ad altre cellule endoteliali e immunitarie. Il seguente metodo descrive la preparazione e la tecnica per la realizzazione di un saggio di adesione flusso based con cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane e linfociti del sangue periferico.
La fase più critica per eseguire con successo un saggio di flusso è garantire che un monostrato sano e confluenti di cellule endoteliali è pronto prima del test di adesione flusso. Cellule endoteliali primarie possono essere difficili da cultura e sensibile alle alterazioni nei metodi di coltura. E 'importante che 1) camere di flusso vengono adeguatamente e uniformemente rivestite con cellule endoteliali in un monostrato, per HSEC usiamo ratto tipo coda collagene I ma può variare per altre popolazioni endoteliali, 2) terreno di coltura appropriato per il tipo di cellula, per HSEC abbiamo descritto il terreno completo nella sezione del protocollo. Altri passi fondamentali sono l'impostazione della pompa a siringa al tasso appropriato per riflettere i livelli fisiologici di shear stress.
Durante il saggio di flusso è necessario evitare bolle d'aria all'interno del circuito di flusso che possono danneggiare il monostrato endoteliale o nastri cellule immuni dalla superficie endoteliale. Ciò può essere evitato ensuring che tutti i tubi silicone e adattatori sono perfusi con tampone di lavaggio prima della connessione, che tutte le bolle d'aria vengono rimosse e che i media sono preriscaldata prima dell'uso. Nel collegare gli adattatori per porte sul MicroSlide è molto importante che vi è una interfaccia liquido / liquido durante la connessione, se c'è aria allora questo formerà uno spazio d'aria all'interno del sistema che interromperà il monostrato endoteliale durante il ritiro siringa passo. La soluzione leucociti nel cilindro della siringa deve agitazione regolare per assicurare che le cellule non si depositano, mantenendo così una densità cellulare costante durante l'esperimento.
Durante le fasi di registrazione è importante garantire l'immagine dello strato endoteliale è sufficientemente concentrata e chiaro che permette l'analisi offline accurata, e che durante la seconda fase del saggio flusso (post leucociti bolo) che viene lasciato un tempo sufficiente durante il tampone di lavaggio fase di prima registrazione viene ricominciato a garantire chetutti i leucociti non aderenti sono state rimosse. Analogamente, è indispensabile utilizzare cellule endoteliali in un monostrato di densità appropriata per prevenire la perdita di cellule che possono interferire con modelli di flusso nei capillari stretti e può anche essere difficile discriminare da grandi leucociti aderenti al microscopio a contrasto di fase. Abbiamo descritto ottimale densità di semina per le cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane, ma puo 'variare tra le diverse popolazioni endoteliali e specie.
Notevoli progressi sono stati compiuti nello studio leucociti assunzioni in modelli animali con la microscopia intravitale. Il principale vantaggio del metodo saggi di adesione flusso è che il reclutamento dei leucociti può essere studiata in un sistema binario con cellule endoteliali umane primarie. Inoltre, queste interazioni possono essere studiati sotto i livelli fisiologici rilevanti di shear stress. E 'importante per confermare i risultati di studi intravitale negli animali con sistemi cellulari umani in quanto vi possono essere differences nelle proprietà endoteliali tra le specie. Una delle limitazioni del flusso saggio è che il reclutamento dei leucociti viene studiato in un ambiente unicellulare del monostrato endoteliale. Inoltre una volta che i leucociti hanno aderito e trasmigrata attraverso l'endotelio non possono essere presenti in numero sufficiente per essere isolati e sottoposti a processi a valle.
Nonostante questi limiti, una volta che il test di adesione flusso è stato masterizzato può essere sviluppato effettuare ulteriori analisi della cascata adesione leucocitaria e adattato ricapitolare un ambiente multicellulare. Registrazione prolungata di singoli campi e l'uso di software di monitoraggio può essere utilizzato per analizzare strisciando comportamento dei leucociti. Inoltre al termine del dosaggio flusso i microslides possono essere interrogati utilizzando microscopia confocale a scansione laser e l'etichettatura immunofluorescenza studiare adesione e trasmigrazione in maggior dettaglio. Inoltre, abbiamo precedentemente sviluppareEd un modello in vitro dove leucociti scorre potrebbero interagire con endotelio epatica condizionato dalla presenza di epatociti. Questo test può anche essere sviluppato per studiare sottopopolazioni di leucociti: il nostro gruppo ha condotto studi con sottoinsiemi come le cellule T regolatorie, cellule B e fegato infiltrante leucociti.
Questi studi sono la prova che il saggio di adesione flusso è un potente strumento per studiare il reclutamento generale e organo leucociti specifico in sistemi umani.
The authors have nothing to disclose.
SS è finanziato da una borsa di studio clinico Wellcome Trust Intermediate, CW da Wellcome Trust programma Grant.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |