גיוס יקוציט אל הכבד מתרחש בתוך הערוצים מיוחדים של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאי אנדותל סינוסי כבד ייחודיים. מיקרוסקופ לעומת השלב של גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי בכבד אדם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי יכול להקל על הבהרת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה.
חדירת יקוציט לתוך רקמת כבד אנושית היא תהליך נפוץ בכל המחלות הכבד דלקתיות המבוגרים. חדירה כרונית יכולה לנהוג הפיתוח של סיסטיק והתקדמות לשחמת כבדה. הבנת המנגנונים המולקולריים המתווכים גיוס יקוציט אל הכבד יכולה לזהות מטרות טיפוליות חשובות למחלת כבד. האינטראקציה מפתח במהלך גיוס יקוציט היא זה של תאים דלקתיים עם האנדותל בתנאים של לחץ גזירה. גיוס אל הכבד מתרחש בתוך ערוצי גזירה הנמוך של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאים בכבד סינוסי אנדותל (HSEC). התנאים בתוך sinusoids בכבד יכולים להיות סכמו על ידי מרוסס leucocytes בערוצים בשורה של monolayers HSEC אדם בספיקות מסוימות. בתנאים אלה leucocytes לעבור שלב קצר קשירה ואחרי הפעלה והידבקות משרד, ולאחריו שלב זחילה וגלגול הבא פני אנדותלשכבה. באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב, ניתן דמיינו כל צעד של 'מפל הידבקות' זה ונרשם ואחרי ניתוח מצב לא מקוון. תאי האנדותל או leucocytes ניתן קודם לכן במעכבי כדי לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות בתהליך זה.
עכשיו זה מבוסס היטב כי גיוס יקוציט באופן כללי כדלקמן הפרדיגמה של מפל הידבקות הרב שלבי 1. זה כרוך בלכידתו של leucocytes מזורם דם על ידי תאי האנדותל המצפים את דפנות כלי הדם. בתחילה, leucocytes לעבור צעד מתגלגל שמתווך על ידי קולטנים selectin או חברי superfamily אימונוגלובולינים. זה מאפשר קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) הביע על פני השטח יקוציט כדי להיות מופעלים על ידי כמוקינים מוצגים על glycocalyx אנדותל. זה מוביל לשינוי של אישור integrin למדינת 'זיקה גבוהה' על פני השטח יקוציט ולעצור והידבקות משרד לאנדותל. הידבקות המשרד בעקבות כך על ידי שינוי צורה וזחילה של יקוציט על כלי השיט. השלב האחרון הוא גלגול דרך monolayer אנדותל, אשר יכול להתרחש דרך נתיבי paracellular או transcellular.
בעוד מפל הידבקות הרב שלבי לתארשל המנגנון הכללי של גיוס יקוציט בתוך הגוף יש הבדלים ספציפיים איברים. בכבד רוב גיוס יקוציט מתרחש בתוך sinusoids בכבד בניגוד לאיברים אחרים שבו גיוס בדרך כלל מתרחש בתוך venules פוסט הנימים 2. Sinusoids הכבד הם סביבת גזירה נמוכה וleucocytes לעבור צעד קשירה קצר לפני למצק הידבקות אשר selectin 2 עצמאיים. ערוצים אלה בשורה של האנדותל סינוסי בכבד שהוא רציף ומכיל fenestrae, הנקבוביות פתוח ננומטר 100-200 בקוטר, ואין קרום במרתף 3. הבהרת המנגנונים המולקולריים אשר מתווכים גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי כבד אנושי יכולה לזהות איבר מטרות טיפוליות ספציפיות למחלות כבד דלקתיות.
מבחני הידבקות זרימה הם כלים חיוניים בלימוד גיוס יקוציט. הם מאפשרים השחזור של recru יקוציטitment בנוכחות של מתח גזירה לנתח הידבקות תחת כוחות מוגדרים היטב. השימוש התכוף ביותר עבור assay הוא הידבקות יקוציט המחקר לmonolayers אנדותל בתרבית או מצעים מטוהרים. זרימת תאים זמינים באופן מסחרי משמשים לינקבו תאים בתנאים של זרימה למינרית בין שני משטחים שטוחים ולאחר מכן לדמיין את התהליך הדינמי של הידבקות במיקרוסקופ 4. קבוצות קודמות הוכיחו כי אינטראקציות דבקים מסוימות להתרחש רק תחת זרם ולא ניתן ללמוד במבחנים סטטיים 5,6.
יש לנו בשימוש בטכניקה זו כדי לשחזר את sinusoids הכבד וללמוד גיוס יקוציט בתנאים של לחץ גזירה נמוך. HSEC האנושי ראשוני בתרבית microslides וleucocytes אז יכול להיות perfused מעל monolayer זה בשיעור של זרימה מחושב לשחזר את מאמץ הגזירה בתוך sinusoids הכבד. מאמץ הגזירה הוא מתח שמוחל מקביל או משיק למשטח כמו מולosed למתח רגיל שהוא בניצב. כל נוזל שנע לאורך גבול יפעיל לחץ גזירה על גבול זה. מאמץ גזירה הוכח להיות מרכיב חיוני של גלגול הלימפוציטים 7. בתנאים אלה ניתן דמיינו בכל שלב של מפל ההידבקות על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. שיטה זו אפשרה תובנות חשובות הגיוס של leucocytes בתוך הכבד, כולל המחקר של מולקולות הדבקות קונבנציונליות 8, את התפקיד של כמוקינים וקולטנים chemokine 9-11, ומולקולות הדבקות טיפוסיות כגון הידבקות כלי דם חלבון -1 (VAP-1 ) 8,12 והלימפה נפוצה וקולט-1 (פיקח-1) 13 האנדותל של כלי דם. בעוד assay זה כבר מוזכר בכמה מהפרסומים של הקבוצה שלנו, התיאור שלה היה קצר ואנחנו צריכים לקחת את ההזדמנות הזאת כדי לספק צעד מפורט על ידי מדריך צעד כדי לעזור בפתרון בעיות ולמנוע טעויות טכניות בעת ניסיוןing assay. יתר על כן, יש לנו לאחרונה שיניתי את המקור של תאי microslide המאפשר שינויים מדויקים בלחץ גזירה. אנו מאמינים כי זה מרחיב את תחולתו של assay לתאי האנדותל ואחרים של מערכת חיסון. השיטה הבאה מתארת את ההכנה וטכניקה לביצוע assay הידבקות זרימה מבוססת עם תאים אנושיים בכבד סינוסי אנדותל וימפוציטים דם היקפיים.
השלב הקריטי ביותר לביצוע זרימה assay הצלחה הוא להבטיח כי monolayer בריא ומחוברות של תאי האנדותל הוא מוכן לפני assay זרימת ההידבקות. תאי האנדותל ראשוניים יכולים להיות קשים לתרבות ורגישה לשינויים בשיטות culturing. חשוב ש1) זרימת תאים הם מצופים כראוי ואחיד עם תאי אנדותל בשכבה; לHSEC להשתמש בסוג קולגן זנב חולדה אני אבל זה עשוי להיות שונה לאוכלוסיות אנדותל אחרות, 2) תרבות בינונית מתאים לסוג התא, עבור HSEC שתארנו בינוני המלאה שלנו בקטע הפרוטוקול. צעדים חיוניים אחרים כוללים הגדרת משאבת המזרק בקצב המתאים כדי לשקף את הרמות פיסיולוגיות של מאמץ גזירה.
במהלך הזרימה assay זה הכרחי כדי למנוע בועות אוויר בתוך הזרם במעגל אשר עלול לגרום נזק monolayer אנדותל או רצועת תאים חיסוניים מפני שטח אנדותל. זה ניתן למנוע על ידי enSuring שכל צינורות סיליקון ומתאמי perfused עם חיץ לשטוף לפני חיבור, שכל בועות האוויר יוסרו ושהתקשורת prewarmed לפני השימוש. בעת חיבור המתאמים ליציאות בmicroslide זה מאוד חשוב שיש ממשק נוזל / נוזל במהלך חיבור, אם יש אוויר אז זה יהווה פער אוויר בתוך המערכת שתשבש את monolayer אנדותל בזמן נסיגת המזרק צעד. פתרון יקוציט בחבית המזרק צריך תסיסה קבועה על מנת להבטיח שהתאים לא להתפשר, ובכך שמירה על צפיפות תאים קבועה לאורך כל הניסוי.
במהלך שלבי ההקלטה חשוב כדי להבטיח את דמותה של שכבת האנדותל היא כראוי ממוקדת וברורה, כדי לאפשר ניתוח מחובר מדויק, וכי במהלך השלב השני של הזרימה assay (בולוס יקוציט הודעה) שמספיק זמן נותר במהלך לשטוף החיץ שלב לפני ההקלטה התחדש על מנת להבטיח כיכל leucocytes nonadherent יוסרו. כמו כן זה הכרחי להשתמש בתאי אנדותל בשכבה של צפיפות המתאימה כדי למנוע אובדן של תאים אשר יכול להפריע לדפוסי זרימה בנימי דם צרים וגם יכול להיות קשה להבחין מleucocytes חסיד גדול יותר תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. יש לנו תארנו צפיפות זריעה אופטימלית לתאי אנדותל סינוסי כבד אנושיים, אבל עשוי להשתנות בין אוכלוסיות שונות אנדותל ומינים.
התקדמות משמעותית נעשתה בלימוד גיוס יקוציט במודלים של בעלי חיים עם מיקרוסקופיה intravital. היתרון העיקרי של שיטת assay זרימת ההידבקות הוא שגיוס יקוציט ניתן ללמוד במערכת בינארית עם תאי אנדותל אנושיים ראשוניים. יתר על כן, ניתן ללמוד האינטראקציות הללו תחת רמות רלוונטיות הפיזיולוגיות של מאמץ גזירה. זה חשוב כדי לאשר את הממצאים של מחקרים בבעלי החיים intravital עם מערכות סלולריות אדם כייתכנו differences בנכסי אנדותל בין מינים. אחת המגבלות של הזרימה assay הוא שגיוס יקוציט נחקרת בסביבה חד תאית של monolayer אנדותל. בנוסף פעם אחת leucocytes יש דבק וtransmigrated פני האנדותל שהם לא יכולים להיות בהווה במספרים מספיקים כדי להיות מבודדים וחשוף לתהליכים במורד הזרם.
למרות מגבלות אלה, ברגע שassay זרימת ההידבקות כבר שולט בו ניתן לפתח לבצע ניתוח נוסף של מפל הידבקות יקוציט ומותאם לשחזר את הסביבה תאית. הקלטה ממושכת של שדות יחיד והשימוש בתוכנת מעקב יכולה לשמש גם כדי לנתח את ההתנהגות של leucocytes זחילה. יתר על כן עם השלמת הזרימה assay יכול להיחקר microslides באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר וסימון immunofluorescent ללמוד הידבקות וגלגול ביתר פירוט. בנוסף, יש לנו לפתח בעבראד מודל במבחנה שבי leucocytes זורם יכולים לקיים אינטראקציה עם האנדותל בכבד המותנה בנוכחות של הפטוציטים. assay זה גם יכול להיות שפותח כדי ללמוד אוכלוסיות של leucocytes: הקבוצה שלנו ביצעה מחקרים עם תת כגון תאי T רגולטורים, תאי B, וleucocytes כבד הסתננות.
מחקרים אלה הם הוכחה לכך שassay זרימת ההידבקות הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור גיוס יקוציט ספציפי בכלל ואיברים במערכות אנושיות.
The authors have nothing to disclose.
SS ממומן על ידי מלגה קלינית Wellcome Trust ביניים, CW על ידי קרן Wellcome תכנית גרנט.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |