Лейкоцитов вербовки в печень происходит в рамках специализированных каналов печеночных синусоидов, которые выстроились по уникальным печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток. Фаза контраст микроскопия набора лейкоцитов через человека печеночной синусоидальной эндотелия в условиях физиологического напряжения сдвига может способствовать выяснению молекулярных механизмов, лежащих в основе этого процесса.
Лейкоцитов проникновение в ткани человека печени является общим процессом во всех взрослых воспалительных заболеваниях печени. Хронический инфильтрация может стимулировать развитие фиброза и прогрессирования цирроза. Понимание молекулярных механизмов, которые опосредуют вербовки лейкоцитов в печень может определить важные терапевтические цели для заболевания печени. Ключ взаимодействие при приеме на работу лейкоцитов, что воспалительных клеток с эндотелием в условиях напряжения сдвига. Набор для печени происходит в течение низкого сдвига каналов печеночных синусоидов, которые выстроились в печени синусоидальных эндотелиальных клеток (HSEC). Условия в печеночных синусоидов можно воспроизводятся путем перфузии лейкоцитов через каналы выстроились человеческими монослоев HSEC в определенных расходах. В этих условиях подвергаются лейкоциты краткое шаг модема с последующей активацией и твердой адгезии, а затем обхода этапе и последующей трансмиграции через эндотелиальныеслой. Использование фаз контрастной микроскопии, каждый шаг этого «адгезии каскада" могут быть визуализированы и записал с последующим автономного анализа. Эндотелиальные клетки или лейкоциты могут быть предварительно обработаны ингибиторами определить роль специфических молекул в этом процессе.
В настоящее время хорошо известно, что вербовка лейкоцитов в целом следует парадигму многоступенчатой адгезии каскада 1. Это включает в себя захват лейкоцитов из крови, протекающий по эндотелиальных клеток, выстилающих стенки сосуда. Первоначально, лейкоциты проходят прокатки шаг, который опосредуется селектину рецепторы или членов надсемейства иммуноглобулинов. Это позволяет G-белками рецепторы (GPCR) экспрессируется на поверхности лейкоцитов быть активирован хемокинов, представленных на эндотелиальной гликокаликса. Это приводит к изменению подтверждения интегринового к "высоким сродством» состоянии на поверхности лейкоцитов и арестовать и фирма адгезии к эндотелию. Фирма адгезия затем следуют изменения формы и сканированию в лейкоцитов на судне. Последним шагом является переселение через эндотелия монослоя, которая может осуществляться посредством парацеллюлярная или трансцеллюлярного маршрутов.
В то время как многоступенчатая адгезия каскад описатьс общий механизм вербовки лейкоцитов в организме есть орган специфические отличия. В печени большинство найма лейкоцитов происходит в течение печеночных синусоидов, в отличие от других органов, где набор обычно происходит в течение посткапиллярных венул 2. Печеночные синусоиды являются экологически низкой скорости сдвига и лейкоциты пройти краткий шаг модема предварительное фирме адгезию который селектином независимую 2. Эти каналы выстланы печеночной синусоидальной эндотелия, который является прерывистой и содержит fenestrae, открытые поры 100-200 нм в диаметре, и не имеют базальную мембрану 3. Выяснение молекулярных механизмов, которые опосредуют вербовки лейкоцитов через человека печеночной синусоидальной эндотелия может определить орган конкретные терапевтические цели для воспалительных заболеваниях печени.
Адгезии потока анализы являются важными инструментами в изучении набора лейкоцитов. Они позволяют реконструкция лейкоцитов recruitment в присутствии напряжения сдвига для анализа адгезии при четко определенных сил. Наиболее частое применение для анализа является изучение адгезии лейкоцитов к культивируемых эндотелиальных монослоев, либо из очищенных поверхностей. Коммерчески доступные камеры потока используются для заливать клетки в условиях ламинарного потока между двумя плоскими поверхностями, а затем визуализировать динамический процесс адгезии на микроскопе 4. Предыдущие группы продемонстрировали, что некоторые клейкие взаимодействия происходить только в потоке и не могут быть изучены в статических анализов 5,6.
Мы использовали эту технику, чтобы резюмировать печеночные синусоиды и изучить набор лейкоцитов в условиях низкой напряжения сдвига. Первичный человеческий HSEC культивируют в microslides и лейкоцитов может быть перфузии в течение этого монослоя со скоростью потока, вычисленного для воспроизведения напряжение сдвига в печеночных синусоидов. Напряжение сдвига является стресс, который применяется параллельно или по касательной к поверхности, как оппosed для нормального напряжения, которая перпендикулярна. Любая жидкость, которая движется вдоль границы окажет напряжения сдвига на этой границы. Напряжение сдвига было показано, чтобы быть важным компонентом лимфоцитов переселении 7. В этих условиях каждый шаг адгезии каскада могут быть визуализированы с помощью фазово-контрастной микроскопии. Этот метод позволил сделать важные выводы в вербовке лейкоцитов в печени в том числе при изучении обычных молекул адгезии 8, роли хемокинов и рецепторов хемокинов 9-11 и атипичных молекул адгезии, таких как сосудистые адгезии белка-1 (VAP-1 ) 8,12 и здравый лимфатической и эндотелия сосудов рецептора-1 (CLEVER-1) 13. Хотя это исследование было упомянуто в нескольких публикациях нашей группы, ее описание было кратким и мы воспользовались этой возможностью, чтобы представить подробный пошаговое руководство, чтобы помочь в устранении неполадок и предотвращения возникновения технических ошибок при попыткеING анализа. Кроме того, мы недавно изменили размещения заказов на предметное стекло камеры, которая позволяет точные изменения в напряжения сдвига. Мы считаем, что это расширяет применимость анализа с другими эндотелиальных и иммунных клеток. Следующий метод описывает получение и методика проведения потока на основе анализа адгезии с человеческими печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток и лимфоцитов периферической крови.
Наиболее важным шагом для успешного выполнения анализа потока является обеспечение того, здоровый и сливающийся монослой эндотелиальных клеток готова до адгезии поток анализа. Первичные эндотелиальные клетки может быть трудно культуры и чувствительны к изменениям в способов культивирования. Важно, что 1) проточных камерах должным образом и равномерно покрыты эндотелиальных клеток в монослое; для HSEC мы используем крысы I типа коллагена хвоста, но это может отличаться для других эндотелиальных населения, 2) культуральную среду подходит для этого типа клеток, для HSEC мы описали нашу полную среду в разделе протокола. Другие важные шаги включают в себя установки шприцевой насос по соответствующей ставке для отражения физиологические уровни напряжения сдвига.
В ходе анализа потока необходимо предотвращает образование воздушных пузырей внутри контура потока, который может привести к повреждению эндотелия монослой или полосы иммунные клетки с поверхности эндотелиальных. Это может быть предотвращено путем ваннойSuring, что все трубки силикон и адаптеры перфузии промывочным буфером до связи, что все пузырьки воздуха удаляются и что средства массовой информации, предварительно нагретую до использования. При подключении адаптера к портам на предметное стекло очень важно, что есть жидкость / жидкость во время соединения, если есть воздух, то это будет формировать воздушный зазор в системе, которые будут нарушать монослой эндотелиальных течение шприца вывода шаг. Лейкоцитов раствор в цилиндр шприца необходимо регулярно перемешивание, чтобы обеспечить, что клетки не оседают, таким образом поддерживая постоянный плотности клеток в течение всего эксперимента.
Во время шагов записи важно обеспечить образ эндотелия слоя адекватно сосредоточены и ясно, чтобы позволить точную автономный анализ, и что во время второй стадии анализа потока (сообщение лейкоцитов болюсной), что достаточно времени осталось в промывочного буфера фаза перед записью возобновляется для того, чтобывсе неприлипшие лейкоциты удаляются. Аналогичным образом необходимо использовать эндотелиальные клетки в монослое соответствующей плотности, чтобы предотвратить потерю клеток, которые могут препятствовать картины течения в узких капиллярах, а также может быть трудно различить от крупных прикрепленных лейкоцитов в рамках этапа контрастной микроскопии. Мы описали оптимальную плотность посева для печеночных синусоидальных эндотелиальных клеток человека, но это может варьироваться от различных эндотелиальных популяций и видов.
Значительный прогресс был достигнут в изучении набора лейкоцитов на животных моделях с прижизненной микроскопии. Основное преимущество метода анализа адгезии потока, что набор лейкоцитов могут быть изучены в бинарной системе с первичными эндотелиальных клеток человека. Кроме того, эти взаимодействия могут быть изучены в физиологических соответствующим уровням напряжения сдвига. Важно, чтобы подтвердить выводы прижизненных исследований у животных с сотовых систем человека, так как возможна разностныхэс в эндотелиальных свойств между видами. Одним из ограничений анализа потока является то, что набор лейкоцитов изучается в одноклеточного среды эндотелия монослоя. Кроме того, как только лейкоциты присоединились и переселено через эндотелий они не могут быть в настоящее в достаточном количестве, чтобы быть изолированы и подвергнутых последующих процессов.
Несмотря на эти ограничения, как только адгезия поток анализа было освоено его можно развивать, чтобы выполнить дальнейший анализ адгезии лейкоцитов каскада и адаптированы к резюмировать многоклеточного среды. Длительное запись отдельных полей и использование отслеживания программного обеспечения может быть использован для анализа ползком поведение лейкоцитов. Кроме того после завершения анализа потока в microslides может быть допрошен с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и Иммунофлуоресцентной маркировку для изучения адгезии и переселение более подробно. Кроме того, мы уже развиватьсяред модель в пробирке, где течет лейкоциты могли взаимодействовать с печеночной эндотелия обусловлено наличием гепатоцитов. Этот анализ также могут быть разработаны для изучения субпопуляций лейкоцитов: наша группа провел исследования с подмножеств таких как регуляторных Т-клеток, В-клеток и печени проникновения лейкоцитов.
Эти исследования свидетельствуют, что адгезия поток анализ является мощным инструментом для изучения общего и органов конкретный набор лейкоцитов в человеческих систем.
The authors have nothing to disclose.
СС финансируется за счет Wellcome Trust промежуточного клинической стипендий, CW на Wellcome Trust Программы Гранта.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |