Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.
Infiltração de leucócitos em tecido de fígado humano é um processo comum em todas as doenças inflamatórias do fígado de adulto. Infiltração crônica pode conduzir ao desenvolvimento de fibrose e progressão para cirrose. Compreender os mecanismos moleculares que medeiam o recrutamento de leucócitos para o fígado poderia identificar alvos terapêuticos importantes para a doença hepática. A interação chave durante o recrutamento de leucócitos é a de células inflamatórias com endotélio em condições de tensão de cisalhamento. Recrutamento para o fígado ocorre dentro dos canais baixos de cisalhamento dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas (HSEC). As condições dentro dos sinusóides hepáticos pode ser recapitulada irrigando leucócitos através de canais revestidos por monocamadas HSEC humanos em vazões específicas. Nestas condições leucócitos sofrer uma breve etapa de amarrar seguido por activação e adesão firme, seguido por um passo de rastreamento e transmigração através do endotélio subsequentecamada. Usando a microscopia de contraste de fase, cada etapa desta "cascata de adesão» pode ser visualizada e registada seguido por análise off-line. As células endoteliais ou leucócitos podem ser pré-tratados com inibidores para determinar o papel de moléculas específicas durante este processo.
Está agora bem estabelecido que o recrutamento de leucócitos em geral segue o modelo da cascata de adesão de várias etapas 1. Isto envolve a captura de leucócitos a partir de sangue que flui por células endoteliais que revestem a parede do vaso. Inicialmente, os leucócitos submetidos a um passo de enrolamento, que é mediada por selectina receptores ou os membros da superfamília das imunoglobulinas. Isto permite à proteína G de receptores acoplados (GPCRs) expressa na superfície de leucócitos para ser activado por quimiocinas apresentados no glycocalyx endotelial. Isto leva à alteração da confirmação da integrina para um estado de "alta afinidade" na superfície dos leucócitos e prender e adesão firme ao endotélio. Adesão firme é seguida por alteração da forma e do rastreamento de leucócitos no navio. O passo final é a transmigração através da monocamada endotelial, que pode ocorrer por via paracelular ou transcelular rotas.
Enquanto a cascata de adesão de várias etapas descrevems o mecanismo geral de recrutamento de leucócitos no corpo há diferenças específicas do órgão. No fígado, a maioria do recrutamento de leucócitos ocorre dentro dos sinusóides hepáticas, em contraste com outros órgãos, onde recrutamento geralmente ocorre dentro das vénulas pós-capilares 2. Os sinusóides hepáticos são um ambiente de baixo cisalhamento e leucócitos passam por um breve passo tethering antes de firmar a adesão que é independente selectina 2. Estes canais estão alinhados pelo endotélio sinusoidal hepática que é descontínua e contém fenestrações, poros abertos 100-200 nm de diâmetro, e carecem de uma membrana basal 3. Elucidar os mecanismos moleculares que medeiam o recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepático humano poderia identificar órgãos alvos terapêuticos específicos para doenças inflamatórias do fígado.
Ensaios de adesão de fluxo são ferramentas essenciais no estudo do recrutamento de leucócitos. Eles permitem a reconstrução de leucócitos recruitment na presença de tensão de cisalhamento para analisar a adesão sob forças bem definidas. O uso mais comum para o ensaio é o estudo de leucócitos adesão a monocamadas endoteliais em cultura ou substratos purificados. Câmaras de fluxo comercialmente disponíveis são utilizadas para perfundir as células sob condições de fluxo laminar, entre duas superfícies planas e depois visualizar o processo dinâmico de aderência sobre um microscópio 4. Grupos anteriores demonstraram que certas interacções adesivas ocorrem apenas sob fluxo e não pode ser estudado em ensaios estáticos 5,6.
Nós temos usado essa técnica para recapitular os sinusóides hepáticos e estudar o recrutamento de leucócitos em condições de baixa tensão de cisalhamento. HSEC humano primário são cultivadas em microslides e leucócitos podem ser perfundidos durante este monocamada, a uma taxa de fluxo calculada para reproduzir a tensão de corte dentro de sinusóides hepáticas. A tensão de corte é uma tensão que é aplicada em paralelo ou tangente a uma superfície como opposed a tensão normal, que é perpendicular. Qualquer líquido que se move ao longo de uma fronteira exercerá uma tensão de cisalhamento em que limite. A tensão de cisalhamento foi demonstrado ser um componente essencial de linfócitos transmigração 7. Sob estas condições, cada passo da cascata de adesão pode ser visualizada por microscopia de contraste de fase. Este método permitiu importantes descobertas sobre o recrutamento de leucócitos no fígado, incluindo o estudo de moléculas de adesão 8 convencionais, o papel de quimiocinas e receptores de quimiocina 9-11, e moléculas de adesão atípicos tais como a adesão vascular protein-1 (VAP-1 ) 8,12 e linfática comum e vascular endotelial receptor-1 (CLEVER-1) 13. Embora este ensaio foi mencionado em várias publicações do nosso grupo, sua descrição foi breve e nós tomamos esta oportunidade para fornecer um detalhado passo a passo para ajudar na solução de problemas e evitar erros técnicos quando tentativação do ensaio. Além disso, nós recentemente mudou o fornecimento de câmaras MicroSlide que permite alterações precisas em tensão de cisalhamento. Acreditamos que esta alarga a aplicabilidade do ensaio de outras células endoteliais e do sistema imunológico. O método seguinte descreve a preparação e a técnica para a realização de um ensaio de adesão de fluxo baseado em células hepáticas sinusoidais endoteliais humanas e de linfócitos de sangue periférico.
A etapa mais importante para a realização com êxito um ensaio de escoamento é garantir que uma monocamada saudável e confluentes de células endoteliais está pronta antes de o ensaio de adesão de fluxo. Células endoteliais primárias pode ser difícil para a cultura e sensível a alterações nos métodos de cultura. É importante que 1) as câmaras de fluxo são de forma adequada e uniformemente revestidos com células endoteliais em monocamada, para HSEC usamos rato de colagénio tipo I da cauda, mas este pode ser diferente para outras populações endoteliais, 2) o meio de cultura apropriado para o tipo de célula, para HSEC descrevemos nosso meio completo na seção de protocolo. Outros passos vitais incluir a criação da bomba de seringa à taxa adequada para refletir níveis fisiológicos de tensão de cisalhamento.
Durante o ensaio de fluxo que é necessário para evitar que as bolhas de ar no interior do circuito de escoamento, que pode danificar a monocamada endotelial ou retirar células do sistema imunológico da superfície endotelial. Isto pode ser evitado por ptsuring que toda a tubagem de silicone e os adaptadores são perfundidos com tampão de lavagem antes da ligação, que todas as bolhas de ar são removidas, e que os meios de comunicação são pré-aquecido antes de ser utilizado. Quando a ligação dos adaptadores para as portas na microlâmina é muito importante que haja uma interface líquido / líquido durante a ligação, se existir qualquer ar, então isso vai formar um espaço de ar dentro do sistema que irá perturbar a monocamada endotelial durante a retirada da seringa passo. A solução de leucócitos no corpo da seringa tem agitação regular, para assegurar que as células não se contentar, mantendo assim uma densidade celular constante ao longo da experiência.
Durante as etapas de gravação, é importante para garantir que a imagem da camada endotelial está adequadamente focado e clara para permitir a análise off-line precisas, e que durante a segunda etapa do ensaio de escoamento (pós leucócitos bolus) que é deixado tempo suficiente durante o tampão de lavagem fase antes da gravação é recomeçado para garantir quetodos os leucócitos não aderentes são removidas. De igual modo, é essencial a utilização de células endoteliais em monocamada de densidade adequada para prevenir a perda de células que podem interferir com os padrões de fluxo em capilares estreitos e pode também ser difícil de distinguir da maiores leucócitos aderentes à microscopia de contraste de fase. Nós descrevemos densidade de semeadura ideal para células endoteliais sinusoidais hepáticas humanas, mas pode variar entre diferentes populações e espécies endoteliais.
Um progresso significativo foi feito no estudo de recrutamento de leucócitos em modelos animais com microscopia intravital. A principal vantagem do método de ensaio de adesão de fluxo é que o recrutamento de leucócitos pode ser estudado num sistema binário com células endoteliais humanas primárias. Além disso, essas interações podem ser estudadas sob níveis fisiológicos relevantes da tensão de cisalhamento. É importante para confirmar resultados de estudos intravital em animais com sistemas celulares humanos como pode haver differences nas propriedades endoteliais entre as espécies. Uma das limitações do ensaio de escoamento é o recrutamento de leucócitos que está a ser estudado num ambiente unicelular da monocamada endotelial. Além disso uma vez que os leucócitos têm aderida e transmigrou através do endotélio não pode estar presente em uma quantidade suficiente para ser isoladas e submetidas a processos a jusante.
Apesar destas limitações, uma vez que o ensaio de adesão de fluxo tem sido dominada que pode ser desenvolvido para realizar posterior análise da cascata de adesão de leucócitos e adaptado para recapitular um ambiente multicelular. Gravação prolongada de campos individuais e do uso de software de monitoramento pode ser usado para analisar o comportamento do rastreamento dos leucócitos. Além disso, após a conclusão do ensaio de escoamento dos microslides pode ser interrogado utilizando microscopia confocal de varrimento laser e rotulagem de imunofluorescência para estudar a adesão e transmigração em mais detalhe. Além disso, temos desenvolver anteriormenteed um modelo in vitro, onde os leucócitos que fluem poderia interagir com endotélio hepático condicionada pela presença de hepatócitos. Este ensaio também pode ser desenvolvido para estudar as subpopulações de leucócitos: nosso grupo realizou estudos com subconjuntos, tais como células T reguladoras, as células B e os leucócitos infiltrantes fígado.
Estes estudos são evidências de que o ensaio de adesão de fluxo é uma ferramenta poderosa para estudar o recrutamento de leucócitos específicos geral e órgão em sistemas humanos.
The authors have nothing to disclose.
SS é financiado por uma bolsa de Clínica Wellcome Trust Intermediate, CW por um Wellcome Trust Programa Grant.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |