肝臓への白血球の動員は、固有の肝臓類洞内皮細胞で裏打ちされている肝正弦波の特殊なチャネル内に発生します。生理学的な剪断応力の条件下でヒト肝臓シヌソイド内皮を通過する白血球動員の位相差顕微鏡は、このプロセスの根底にある分子機構の解明を容易にすることができる。
ヒト肝組織への白血球の浸潤は、すべての大人の炎症性肝疾患では一般的なプロセスです。慢性浸潤が肝硬変に線維症および進行の開発を推進することができます。肝臓に白血球動員を仲介する分子機構を理解することは、肝疾患のための重要な治療標的を同定できた。白血球の募集時の重要な相互作用は、せん断応力条件下で内皮と炎症性細胞のことである。肝臓への動員は、肝類洞内皮細胞(HSEC)によって裏打ちされている肝正弦波の低せん断チャンネル内で行われます。肝類洞内の条件は、特定の流量で人間HSEC単層が並んチャネルを通して白血球を灌流によってで要約することができます。これらの条件では、白血球は、内皮を横断クロールステップとその後の転生に続く活性化と強固な接着が続く短時間のテザリング段階を経る層。位相差顕微鏡を用いて、この「接着カスケード 'の各ステップは、可視化およびオフライン分析により追跡記録することができる。内皮細胞または白血球は、このプロセス中に特定の分子の役割を決定するために、阻害剤で前処理することができる。
それが現在では一般的には白血球の募集は多段階の接着カスケード1のパラダイムに従っていることが確立されている。これは、血管壁を裏打ちする内皮細胞によって血液を流すの白血球の捕捉を伴う。最初に、白血球は、受容体または免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーセレクチンにより媒介される圧延工程を経る。これは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)は、内皮糖衣上に提示ケモカインによって活性化される白血球の表面上で発現を可能にする。これは白血球表面上の「高親和性」状態にインテグリン確認の変更につながり、逮捕し、内皮への強固な接着。強固な接着は、その後、容器に白血球の形状変化とクロールが続いている。最後のステップは、傍細胞または経細胞経路を介して発生する可能性が内皮単層を介して、輪廻です。
多段階の接着カスケードは説明しながら、S本体内の白血球募集の一般的な機構は、器官特異的な違いがあります。肝臓では白血球の動員の大多数は募集は一般的に後毛細血管細静脈2内で発生した他の臓器とは対照的に肝類洞内で発生します。肝類洞は低剪断環境であり、白血球は、セレクチン依存しない2で接着を会社に前に簡単なテザリング段階を経る。これらのチャネルは、不連続であるとfenestraの複数形が含まれ、肝正弦内皮によって並ぶ直径開孔100〜200 nmであり、基底膜3を欠いている。ヒト肝正弦内皮を通過する白血球動員を仲介する分子機構を解明することは、炎症性肝疾患のための臓器特異的な治療標的を同定できた。
フロー接着アッセイは、白血球動員を研究する上で欠かせないツールです。彼らは、白血球の再構築を可能にするrecru明確に定義された力の下での密着性を分析するためのせん断応力の存在下でitment。アッセイのための最も頻繁に使用すると、培養内皮単層または精製された基材への研修白血球接着です。市販のフローチャンバーは、2つの平坦面との間の層流の条件下で細胞を灌流し、次いで顕微鏡4上に接着の動的なプロセスを視覚化するために使用される。以前のグループは、特定の接着相互作用しか流れの下で行われることが実証されていると、静的アッセイ5,6において研究することができない。
我々は、肝の正弦波を再現し、低せん断応力の条件下での白血球動員を研究するためにこの手法を使用している。初代ヒトHSECマイクロスライドおよび白血球で培養し、肝臓の洞様の中にせん断応力を再現するために計算された流量で、この単層の上に灌流することができます。せん断応力は、OPP等の表面に対して平行または接線方向の印加される応力である垂直な垂直応力にosed。境界に沿って移動している任意の流体は、その境界にせん断応力を発揮します。せん断応力は、リンパ球遊出7の必須成分であることが示されている。これらの条件下で接着カスケードの各ステップは、位相差顕微鏡によって可視化することができる。この方法は、従来の接着分子の研究8、ケモカインおよびケモカイン受容体9から11の役割、およびそのような血管接着タンパク質-1(VAP-1などの非定型接着分子を含む肝臓内白血球のリクルートに重要な洞察を可能にした)8,12および共通リンパや血管内皮受容体-1(CLEVER-1)13。このアッセイは、当社グループの出版物のいくつかに言及してきたが、その説明は簡潔されており、我々は、トラブルシューティングに役立つ技術的なエラーを防ぐためのステップガイドでは、詳細な手順を提供するために、この機会を取ったときの試みアッセイをING。さらに、我々は最近、せん断応力で正確な変更を可能にするマイクロスライドチャンバの調達を変更しました。我々は、これが他の内皮および免疫細胞へのアッセイの適用可能性を広げると信じています。以下の方法は、ヒト肝臓類洞内皮細胞および末梢血リンパ球とフローベースの接着アッセイを実施するための調製および技術が記載されている。
首尾フローアッセイを実施するための最も重要なステップは、内皮細胞の健康でコンフルエント単層が前に流れ接着アッセイする準備ができていることを保証することである。初代内皮細胞は、培養が困難と培養方法の変化に敏感であることができる。それは、1)フローチャンバーが適切にかつ均一に単層の内皮細胞で被覆されることが重要である。HSECために、我々は、ラット尾部コラーゲンタイプIを使用するが、これは他の内皮集団について異なる場合があり、2)、培養培地は、細胞のタイプに適したHSEC私たちは、プロトコルのセクションで私達の完全培地を記載している。他の重要なステップは、せん断応力の生理学的レベルを反映するために適切な速度でシリンジポンプを設定することを含む。
フローアッセイ中には、内皮細胞単層に損傷を与えたり、内皮表面から免疫細胞を除去することができる流れ回路内の気泡を防止する必要がある。これは、英語を防止することができるすべてのシリコンチューブとアダプターは、すべての気泡が除去されることを、接続前に、洗浄緩衝液で灌流し、メディアは使用前に温めておいていることをしていることをジューリング。マイクロスライド上のポートにアダプタを接続する場合、接続時の液/液界面が存在することが非常に重要である任意の空気がある場合、これは、シリンジ離脱中の内皮単層を破壊するシステム内の空隙を形成するステップ。シリンジバレル内の白血球溶液は、細胞がこのようにして、実験を通して一定の細胞密度を維持し、沈降しないことを保証するために定期的な攪拌を必要とする。
記録工程の間には、内皮層の画像が適切に焦点を合わせ、正確なオフライン分析を可能にするためにクリアされていることを確認することが重要であり、それはフローアッセイ(ポスト白血球ボーラス)の第二ステップの間に十分な時間を、洗浄緩衝液中に残っている記録前相は、次のことを確認するために再開されるすべての非付着白血球が削除されます。同様に、狭い毛細血管内の流れパターンを妨害し得る細胞の損失を防止し、また位相差顕微鏡下でより大きな付着性の白血球から区別するのは難しいことができ、適切な濃度の単層の内皮細胞を使用することが必須である。我々はヒト肝類洞内皮細胞に最適な播種密度を記載しているが、これは別の内皮人口や種間で異なる場合があります。
著しい進歩が生体顕微鏡を用いて動物モデルにおける白血球動員を研究してなされたものである。流量接着アッセイ法の主な利点は、白血球動員が、初代ヒト内皮細胞を用いて二成分系で研究することができることである。さらに、これらの相互作用は、ずり応力の生理学的に適切なレベルの下で研究することができる。 differencがあるかもしれないとして、それは人間のセルラーシステムとの動物で生体内の研究の調査結果を確認することは重要である種間の内皮性質のES。フローアッセイの制限の1つは、白血球の動員は、内皮単層の単細胞環境において検討されていることである。白血球が内皮を通過付着し転生したらまた彼らは孤立し、下流の処理が施されるのに十分な数で存在していなくてもよい。
流量接着アッセイが習得された後、これらの制限にもかかわらず、白血球接着カスケードのさらなる分析を実行するために開発され、多細胞環境を再現するように構成することができる。単一フィールドおよびトラッキングソフトウェアの使用の延長記録が白血球のクロールの動作を分析するために使用することができる。さらにフローアッセイの完了時にマイクロスライドをより詳細に接着および遊走を研究するためにレーザー走査共焦点顕微鏡法および免疫蛍光標識を用いて調べることができる。さらに、我々は以前に開発してきた流れる白血球が肝細胞の存在によって調整肝内皮と相互作用することができるin vitroモデルを編このアッセイはまた、白血球の亜集団を研究するために開発することができる:私達のグループは、調節性T細胞、B細胞、および肝臓浸潤白血球などのサブセットを使用して研究を行った。
これらの研究は、フロー接着アッセイは、人間システムにおける一般的および臓器特異白血球動員を研究する強力なツールであることの証拠である。
The authors have nothing to disclose.
SSはウェルカムトラストプログラムグラントウェルカムトラスト中間臨床フェローシップ、CWによって資金を供給される。
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |