Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.
Leukozyten-Infiltration in menschlichem Lebergewebe ist ein gängiges Verfahren in aller erwachsenen entzündlichen Lebererkrankungen. Chronische Infiltration kann die Entwicklung der Fibrose und die Progression der Zirrhose zu fahren. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung in die Leber vermitteln könnten wichtige therapeutische Ziele für Lebererkrankungen zu identifizieren. Der Schlüssel Interaktion während Leukozyten-Rekrutierung ist, dass der Entzündungszellen mit Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung. Recruitment der Leber tritt innerhalb der geringen Scher Kanäle der Lebersinuskurven, die durch Lebersinus Endothelzellen (HSEC) ausgekleidet sind. Die Bedingungen in den Lebersinuskurven können durch Perfusion Leukozyten durch die Kanäle durch menschliche HSEC Monoschichten an bestimmten Flussraten ausgekleidet rekapituliert werden. Unter diesen Bedingungen Leukozyten durchlaufen eine kurze Anbindung Schritt, gefolgt von der Aktivierung und feste Haftung, gefolgt von einem Schritt kriechen und nachfolgende Transmigration durch die endothelialeSchicht. Mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie, kann jeder Schritt dieser "Adhäsionskaskade 'visualisiert und aufgezeichnet, gefolgt von Offline-Analyse werden. Endothelzellen und Leukozyten können mit Inhibitoren vorbehandelt, um die Rolle von spezifischen Molekülen während dieses Prozesses zu bestimmen.
Es ist nun bekannt, dass Leukozytenrekrutierung im Allgemeinen folgt dem Paradigma der mehrstufigen Kaskadenhaftung ein. Dies beinhaltet die Erfassung von Leukozyten aus Blut fließt durch Endothelzellen der Gefäßwand. Zunächst Leukozyten durchlaufen einen Walzschritt, der durch Selektin-Rezeptoren oder Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie vermittelt wird. Dies ermöglicht G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), das auf der Oberfläche von Leukozyten am Endothel Chemokine Glykokalyx dargestellt aktiviert. Dies führt zur Veränderung der Integrin-Bestätigung zu einem "hohe Affinität" Zustand auf der Oberfläche der Leukozyten und verhaften und feste Adhäsion an das Endothel. Firm Haftung wird dann durch Formänderung und Crawling der Leukozyten an der Gefäß gefolgt. Der letzte Schritt ist durch das Trans endothelialen Monoschicht, die über den parazellulären oder transzellulären Route erfolgen kann.
Während der mehrstufigen Kaskadenhaftung beschreibens der allgemeine Mechanismus der Leukozyten-Rekrutierung innerhalb des Körpers gibt es organspezifische Unterschiede. In der Leber der Großteil der Leukozyten-Rekrutierung erfolgt innerhalb der Lebersinuskurven im Gegensatz zu anderen Organen, wo Rekrutierung innerhalb der Post-Venolen 2 tritt in der Regel. Die Lebersinuskurven sind ein niedriger Scher Umwelt und Leukozyten unterziehen eine kurze Tethering Schritt vor, um die Haftung, die Selektin wird unabhängig 2 festigen. Diese Kanäle werden durch die Lebersinus Endothel, die diskontinuierlich und enthält fenestrae, offenen Poren 100-200 nm im Durchmesser gefüttert, und es fehlt eine Basalmembran 3. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel vermitteln könnte organspezifische therapeutische Ziele für entzündliche Lebererkrankungen zu identifizieren.
Flow-Adhäsions-Assays sind wesentliche Instrumente bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung. Sie erlauben die Rekonstruktion der Leukozyten recruitment in Gegenwart von Scherbeanspruchung, um die Haftung unter definierten Kräfte zu analysieren. Die häufigste Verwendung für den Test ist die Untersuchung Leukozytenadhäsion zu kultivierten Endothelzellen Monoschichten oder gereinigten Substraten. Im Handel erhältliche Strömungskammern werden verwendet, um Zellen unter Bedingungen einer laminaren Strömung zwischen zwei ebenen Flächen durchströmen und dann visualisieren den dynamischen Prozess der Haftung auf ein Mikroskop 4. Zurück Gruppen haben gezeigt, dass bestimmte adhäsive Wechselwirkungen unter Fluss nur stattfinden, und kann nicht in statischen Tests 5,6 sucht werden.
Wir haben diese Technik verwendet, um die Lebersinuskurven zu rekapitulieren und zu studieren Leukozytenrekrutierung unter Bedingungen geringer Scherbeanspruchung. Primäre humane HSEC in Mikroobjekttragerglaschen Leukozyten kultiviert und kann dann über diese Monoschicht bei einer Fließgeschwindigkeit berechnet, um die Scherspannung in Sinusleber reproduzieren perfundiert werden. Die Scherspannung ist eine Spannung, die parallel oder tangential zu einer Oberfläche aufgebracht wird oppauf Normalspannung, die senkrecht osed. Jedes Fluid, das entlang einer Grenze bewegt wird eine Scherbeanspruchung auf dieser Grenze auszuüben. Scherbeanspruchung ist gezeigt worden, eine wesentliche Komponente der Lymphozytentrans 7 sein. Unter diesen Bedingungen wird jeder Schritt des Adhäsionskaskade durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert werden. Dieses Verfahren hat wichtige Einblicke in die Rekrutierung von Leukozyten in der Leber einschließlich der Untersuchung der herkömmlichen Adhäsionsmoleküle 8, die Rolle von Chemokinen und Chemokinrezeptoren 9-11 und atypische Adhäsionsmolekülen wie dem vaskulären Adhäsionsmolekül-1 (VAP-1 erlaubt ) 8,12 und gemeinsame Lymph-und vaskulären endothelialen Rezeptor-1 (CLEVER-1) 13. Während dieser Assay wurde in mehreren Publikationen unserer Gruppe erwähnt wurde, hat seine Beschreibung war kurz und wir haben diese Gelegenheit genutzt, um eine detaillierte Schritt für Schritt Anleitung zur Verfügung stellen, um bei der Fehlersuche helfen und verhindern, dass technische Fehler beim Versuch,ten des Assays. Darüber hinaus haben wir vor kurzem die Beschaffung von Mikroobjektkammern, die genauen Änderungen in der Scherbeanspruchung ermöglicht verändert. Wir glauben, dass dies erweitert die Anwendbarkeit des Assays zu anderen Immunzellen und Endothelzellen. Das folgende Verfahren beschreibt die Herstellung und Verfahren zur Durchführung einer flussbasierten Haft Assay mit menschlichen Lebersinus Endothelzellen und Lymphozyten des peripheren Blutes.
Der kritischste Schritt für eine erfolgreiche Durchführung Flow-Assay wird sichergestellt, dass eine gesunde und konfluente Monoschicht von Endothelzellen bereit ist vor der Durchfluss Adhäsionstest. Primäre Endothelzellen schwierig, Kultur und sensibel auf Veränderungen in der Kultivierungsverfahren sein kann. Es ist wichtig, dass 1) Strömungskammern ausreichend und gleichmäßig mit endothelialen Zellen in einer Monoschicht beschichtet ist, für HSEC wir Rattenschwanzkollagen vom Typ I, aber dies kann für andere endotheliale Populationen unterscheiden, 2) Kulturmedium für die Zelltyp geeignet, für HSEC haben wir unsere Komplettmedium in der Protokoll-Abschnitt beschrieben. Weitere wichtige Schritte sind die Festlegung der Spritzenpumpe mit der entsprechenden Rate auf physiologische Werte der Scherspannung zu reflektieren.
Während des Flow-Assay ist es notwendig, Luftblasen innerhalb des Strömungskreislaufs, der die endotheliale Monoschicht beschädigen oder Streifen Immunzellen aus dem Endothel Oberfläche zu verhindern. Dies kann durch en verhindert werdenSüring, dass alle Silikonschlauch und Adapter sind mit Waschpuffer vor der Verbindung durchblutet, dass alle Luftblasen entfernt werden und dass die Medien vor der Verwendung vorgewärmt. Wenn die Adapter an die Anschlüsse auf der Mikroobjekt ist es sehr wichtig, dass es eine Flüssigkeit / Flüssigkeit-Grenzfläche während der Verbindung, wenn es irgendeine Luft, dann wird dies einen Luftspalt innerhalb des Systems, die den endothelialen Monoschicht während der Spritze Rückzug stören wird auszubilden Schritt. Die Leukozyten-Lösung in den Spritzenzylinder regelmässige Bewegung zu gewährleisten, dass die Zellen sich nicht absetzen, wodurch die Aufrechterhaltung einer konstanten Zelldichte während des gesamten Experiments.
Während der Aufzeichnungsschritte ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Bild der endothelialen Schicht ausreichend scharf und klar, präzise Offline-Analyse zu ermöglichen, und dass während des zweiten Schritts des Flow-Assay (post Leukozyten-Bolus), dass genügend Zeit während des Waschpuffer übrig Phase vor der Aufzeichnung wieder aufgenommen wird, um sicherzustellen, dassAlle nicht-adhärenten Leukozyten entfernt werden. Ebenfalls ist es wichtig, Endothelzellen Verwendung in einer Monoschicht von geeigneter Dichte, um den Verlust von Zellen, die mit Strömungsmuster in engen Kapillaren stören können, zu verhindern und auch schwer aus größeren anhaftenden Leukozyten unter Phasenkontrastmikroskopie diskriminiert werden. Wir haben optimale Aussaatdichte für den menschlichen Lebersinus Endothelzellen beschrieben, aber das kann zwischen verschiedenen Populationen und Arten endothelialen variieren.
Bedeutende Fortschritte bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung in Tiermodellen mit Intravitalmikroskopie gemacht worden. Der Hauptvorteil der Strömungshafttestverfahren ist, dass Leukozyten-Rekrutierung in einem binären System mit primären humanen Endothelzellen untersucht werden. Darüber hinaus können diese Wechselwirkungen unter physiologischen Ebenen in die Scherbeanspruchung untersucht werden. Es ist wichtig, Ergebnisse der Intravital-Studien an Tieren mit menschlichen Zellsysteme zu bestätigen, da es sein kann differences in Endothelzellen Eigenschaften zwischen den Arten. Eine der Einschränkungen des Flow-Assay ist, dass Leukozytenrekrutierung ist in einem einzelligen Umgebung der endothelialen Monoschicht untersucht. Darüber hinaus, wenn die Leukozyten haben halten und durch das Endothel transmigrierten sie nicht in ausreichender Zahl in den isoliert und nachgelagerten Prozessen unterzogen werden anwesend sein.
Trotz dieser Einschränkungen, wenn die Strömungs Adhäsionstest bewältigt wurde sie entwickelt werden können, um eine weitere Analyse der Leukozytenadhäsion Kaskade durchzuführen und geeignet ist, einen multizellulären Umgebung zu rekapitulieren. Längerer Aufnahme von einzelnen Feldern und den Einsatz von Tracking-Software verwendet werden, um kriechen Verhalten der Leukozyten zu analysieren. Ferner nach Beendigung des Flow-Assay kann unter Verwendung der Mikroobjekt konfokalen Laserrastermikroskopie und Immunfluoreszenz-Markierung zur Adhäsion und Trans genauer zu untersuchen abgefragt werden. Zusätzlich entwickeln wir bereits habened ein in vitro-Modell, bei dem fließenden Leukozyten konnte mit Leber Endothel durch die Anwesenheit von Hepatozyten Anlage interagieren. Dieser Test kann auch entwickelt, um Subpopulationen von Leukozyten zu untersuchen: hat unsere Gruppe mit Teilmengen, wie regulatorische T-Zellen, B-Zellen und Leber infiltrieren Leukozyten durchgeführten Studien.
Diese Studien belegen, dass die Strömung Haftung Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur allgemeinen und organspezifische Leukozytenrekrutierung in menschlichen Systemen zu studieren.
The authors have nothing to disclose.
SS wird durch ein Wellcome Trust Zwischen Clinical Fellowship, CW durch ein Wellcome-Trust-Programm Zuschuss finanziert.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |