Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con bioluminiscente<em> Citrobacter rodentium</em> Y el seguimiento longitudinal de la colonización bacteriana mediante tomografía luz difusa 3D compuesto con μCT de imágenes para crear una película de 4D<em> C. rodentium</em> Infección.
Este protocolo describe los pasos necesarios para el seguimiento longitudinal de una infección bacteriana bioluminiscente mediante tomografía 3D compuesta de imágenes con luz difusa integrada μCT (DLIT-μCT) y el uso posterior de estos datos para generar una película del ciclo de infección de cuatro dimensiones (4D). Para desarrollar las películas de infección 4D y para validar la formación de imágenes DLIT-μCT para estudios de infección bacteriana usando un espectro CT IVIS, hemos utilizado la infección con C. bioluminiscente rodentium, que causa colitis espontánea en ratones. En este protocolo, se esboza la infección de ratones con bioluminiscente C. rodentium y la monitorización no invasiva de la colonización por el diario de imágenes DLIT-μCT y enumeración de bacterias de las heces durante 8 días.
El uso de la IVIS Spectrum CT facilita la co-registro sin fisuras de las exploraciones ópticas y μCT utilizando una única plataforma de imágenes. La modalidad μCT dosis bajas permite la generación de imágenes de los ratonesen múltiples puntos de tiempo durante la infección, proporcionando localización anatómica detallada de focos de bacterias bioluminiscentes en 3D sin causar artefactos de la radiación acumulativa. Es importante destacar que el cine 4D de ratones infectados proporcionan una poderosa herramienta de análisis para monitorear la dinámica de colonización bacteriana in vivo.
Modelos animales pequeños, en particular, aquellos ratones que utilizan, se utilizan habitualmente para investigar la patogénesis bacteriana o para poner a prueba las estrategias de intervención para las infecciones, tales como antibióticos, probióticos, prebióticos y vacunas 1-7. Los principales lecturas experimentales de infecciones animales pequeños son la carga de patógenos, la localización espacial y temporal de la infección, y los cambios en la respuesta inmune del organismo infectado. En imagen óptica in vivo es una herramienta valiosa para la investigación de enfermedades infecciosas y se pueden utilizar para supervisar múltiples lecturas experimentales mediante el uso de genes informadores (luciferasa, proteínas fluorescentes, beta-lactamasa, etc), colorantes fluorescentes, nanopartículas o sondas quimioluminiscentes dirigidos a una proteína, proceso biológico, o microorganismo 6.
Imágenes de bioluminiscencia (BLI) es una modalidad de imagen óptico utilizado para controlar la colonización de los animales pequeños, tales como ratones y ratas, por bac patógenaria 3,6,8,9. Los ratones se infectan con bacterias recombinantes que expresan una luciferasa, tales como el operón lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bacterias pueden entonces ser detectados a través de su producción de luz usando un CCD basado en formación de imágenes in vivo del sistema 3,6,9. Es importante destacar que sólo los microorganismos metabólicamente activas son bioluminiscentes (BL), es decir, sólo las células bacterianas viables se detectan mediante esta metodología 10,11. Uso de 2D BLI, la ubicación de la fuente de BL se infiere de la superficie del animal en el que se emitió la señal 8. La localización anatómica exacta de los focos BL in vivo tiene que ser determinada mediante el análisis ex vivo de órganos 3,6,9 En contraste, tomografía compuesto 3D difusa la luz de imagen (DLIT) puede ser utilizado para compilar una reconstrucción 3D cuantitativa de la BL fuente 12. DLIT se lleva a cabo mediante la recopilación de BL imágenes tomadas con filtros ópticos de paso de banda estrecha definidos yposteriormente insertando en ellos una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 3D 1,7,12,13.
Actualmente, modalidad de imágenes múltiples es la única metodología disponible para obtener verdadera localización anatómica no invasiva de bioluminiscente focos in vivo sin la necesidad de un análisis ex vivo. Recientemente, se utilizó una combinación de DLIT co-registrado con μCT formación de imágenes para evaluar Citrobacter rodentium (C rodentium) dinámica de colonización después del tratamiento profiláctico con una bacteria probiótica 7. C. rodentium es un patógeno entérico murino específico utilizado para modelar la infección humana por enteropatógenos y enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infección rodentium causas de la colitis, típicamente asociado con la pérdida leve de peso, diarrea, polarizado respuesta inmune Th1 y cambios patológicos distintos, incluyendo hiperplasia de las criptas del colon y adhesión y borrado lesión formatiel 14. Además de esto, C. patogénesis rodentium se ha estudiado a fondo el uso de BLI y su dinámica de colonización en ratones C57BL/6J están bien documentadas, por lo que esta bacteria un microorganismo modelo ideal para su uso con múltiples modalidades de imagen 3,4,7.
Este protocolo es el primero en describir una metodología para la formación de imágenes DLIT-μCT integrado de una infección bacteriana utilizando una única plataforma de formación de imágenes multimodalidad, el IVIS Spectrum CT, y la generación de una película de 4D que muestra la verdadera dinámica de esta infección no invasiva.
La película 4D de infección bacteriana es una herramienta útil para visualizar e interpretar grandes cantidades de datos de imágenes multimodalidad rápida y fácilmente. Esta técnica facilita el análisis detallado de cómo una infección se propaga a través de un ratón individual y se puede utilizar para investigar cómo la eliminación de host o genes bacterianos o particular, las estrategias de intervención efecto de la carga bacteriana, la distribución, y la localización durante un estudio longitudinal 7. Estos videos también ofrecen materiales didácticos útiles y un medio de difusión de información al público.
Hay varios pasos críticos en este protocolo que podrían afectar a la calidad de los datos obtenidos a partir de imágenes DLIT-μCT y la capacidad para compilar un video 4D de la infección. La parte más importante de este protocolo es el éxito de la infección y homogénea de los ratones con C. rodentium. Es esencial que los ratones utilizados para el estudio son entre 18-20 g y que la bacrial inóculos se preparan y aproximadamente 5 x 10 9 ufc, como se ha descrito previamente 2,3. Antes de la infección de los ratones es importante comprobar que el inóculo es bioluminiscente usando el espectro CT y una vez que el inóculo se ha preparado, que debe ser homogeneizada continuamente delante de cada ratón se gavaged para asegurar que los ratones reciben dosis infecciosas similares. La imagen DLIT-μCT de los ratones se ha optimizado para que la función de exposición automática en el software 4.3.1 Imagen Living determina automáticamente los parámetros de imagen óptimos para la señal de estar bien por encima del ruido. Sin embargo, la función de exposición automática se basa en la configuración y los parámetros definidos por el usuario que necesitan ser modificados como se describe en el procedimiento. De no hacerlo, dará lugar a imágenes de baja calidad con un bajo número de fotones recogidos que no den lugar a una progresión evidente en la infección, como los ajustes de fábrica del Spectrum CT de exposición automática se programan para los tumores que expresan imágenesla luciferasa de luciérnaga. Reconstrucciones realizaron con 560 a 620 nm dan la mejor concordancia entre los datos simulados y medidos y, por lo tanto, son los datos más fiables para incluir en la reconstrucción.
Una limitación al uso de DLIT-μCT es que la radiación ionizante de la exploración μCT provoca daño de la radiación subletal que es acumulado en un estudio longitudinal 18. Exposición a la radiación subletal puede debilitar la respuesta inmune, provocar daños en el ADN, y la apoptosis en los órganos internos 19. En última instancia, daños por radiación subletal acumulada puede causar la muerte si la DL 50/30 para la radiación ionizante se excede, que está entre 5 y 7 Gy dependiendo de la cepa de ratón y la edad de los ratones utiliza 18,20,21. Aunque algunos de los daños molecular de las radiaciones ionizantes puede curar, ya que el principio general es el de estimar la dosis de forma conservadora, esto no suele ser contabilizada en la planificación del estudio. En cambio, el objetivo es mantenerse lo más below estos límites como sea posible al tiempo que el cumplimiento de los objetivos del estudio. Esto es particularmente importante en este estudio debido a la respuesta inmune normal a la infección, la frecuencia de formación de imágenes, y el hecho de que transgénico, inmuno-compuesto, o muy infectado animales pueden ser más susceptibles a la radiación ionizante.
Al planificar el experimento para generar una película 4D de la infección, es importante tener en cuenta la longitud del experimento, el número de μCT escanea requerido durante este periodo y la DL 50/30 para la radiación ionizante para la cepa de ratón que está siendo utilizado. Otra limitación potencial de DLIT-μCT es la fuerza de la expresión del indicador dentro de la cepa bacteriana utilizada, ya que esto afectará límites de detección bacterianas y los tiempos de formación de imágenes. Es muy recomendable que los investigadores utilizan validados cepas bacterianas que son totalmente virulento, pero optimizado para máxima operón lux expresión, como se ha demostrado previamente para BLI2,3.
Una advertencia para el diseño actual de la formación de imágenes 4D es que cada película se compone de exploraciones DLIT-μCT individuales que tienen diferente escala de fotones. Esto puede hacer que las imágenes difíciles de interpretar si los cambios en la localización de la BL focos, o su intensidad son sutiles, o si hay un foco BL intensa rodeada por múltiples focos débil. Por lo tanto, para visualizaciones longitudinales, es importante para mantener las barras de color consistente a través de los puntos de tiempo.
El concepto de una película 4D de la infección se puede aplicar a cualquier patógeno bacteriano convenientemente etiquetado. El desarrollo futuro de esta técnica tendrá como objetivo utilizar la tomografía de imágenes de fluorescencia (FLIT), así como DLIT para facilitar la investigación de las respuestas del huésped a la infección usando una combinación de patógenos bacterianos y bioluminiscentes inyectables sondas fluorescentes cerca de infrarrojos para investigar las respuestas del huésped a la infección. Además de esto, en este protocolo sólodescriben el uso de bacterias bioluminiscentes para crear películas 4D de la infección. Sin embargo, en algunos casos, puede ser necesario el uso de bacterias marcadas fluorescentes, por ejemplo, etiquetado con IRFP, de modo que el reportero bioluminiscencia se puede utilizar para la investigación genética del huésped durante la infección. Es importante destacar que el uso de imágenes multimodalidad que combina DLIT / FLIT-μCT nos permitirá investigar de manera no invasiva varios parámetros durante una infección bacteriana, lo que contribuirá de manera significativa a la reducción, refinamiento y reemplazo del uso de animales en la investigación científica como se indica en la iniciativa del NC3R ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
El servicio de imágenes en vivo en el Imperial College fue financiado por el MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |