멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을 설명<em> Citrobacter rodentium</em> 세균성 식민지의 종 모니터링의 4D 영화를 만들 μCT 이미징 복합 3D 확산 광 영상 단층 촬영을 사용하여<em> C. rodentium</em> 감염.
이 프로토콜은 길이 방향 감염 사이클의 네 가지 차원 (4D) 영화를 생성하는 통합 μCT (DLIT-μCT)와 복합 3D 확산 광 영상 단층 촬영 및이 데이터의 연속적인 사용을 사용하여 발광 세균 감염을 모니터링하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 4D 감염 영화를 개발하고 IVIS 스펙트럼 CT를 사용하여 세균 감염 연구를위한 DLIT-μCT 이미징을 검증하기 위해, 우리는 발광 C. 감염에 사용 생쥐의 자기 제한 대장염의 원인 rodentium. 이 프로토콜에서는, 우리는 발광 C.와 생쥐의 감염을 설명 rodentium 일상 DLIT-μCT 이미징 8 일 동안 배설물에서 세균 열거 형으로 식민지의 비 침습 모니터링.
IVIS 스펙트럼 CT의 사용은 하나의 영상 플랫폼을 사용하여 광학 및 μCT 검사의 원활한 공동 등록을 용이하게합니다. 저용량 μCT 양상은 마우스의 이미지를 수누적 방사선 유물을 유발하지 않고 3D에있는 발광 박테리아 병소의 상세한 해부학 적 지역화를 제공 감염 동안 여러 시간 지점에서. 중요한 것은, 감염된 생쥐의 4D 영화는 생체 내에서 세균 식민지 역학을 모니터링 할 수있는 강력한 분석 도구를 제공합니다.
작은 동물 모델은 특히 그 활용 생쥐에서 일상적으로 세균 병인을 조사하거나 항생제, 생균제, 프리 바이오 틱스와 백신 1-7로 감염에 대한 개입 전략을 테스트하는 데 사용됩니다. 작은 동물 감염의 주요 실험 판독 값. 병원균 부하 감염의 공간과 시간적 현지화 및 감염 유기체의 면역 반응에 대한 변경됩니다 생체 내 광학 이미징 감염증 연구를위한 유용한 도구입니다 여러 모니터링 할 수 있습니다 리포터 유전자의 사용 (루시 페라 제, 형광 단백질, 베타 – lactamase를, 등)를 통해 실험 판독 값, 형광 염료, 나노 입자 또는 화학 발광 프로브 단백질, 생물 공정, 또는 미생물 6을 대상으로.
생물 발광 영상 (BLI)는 병원성 세균에 의해, 같은 마우스 및 쥐 등 작은 동물의 식민지을 모니터링하는 데 사용되는 광학 이미징 양상이다RIA 3,6,8,9. 마우스는 같은 Photorhabdus luminescens에서 럭스 CDABE 오페론로, 루시퍼.이 박테리아는 그 생체 내 이미징 시스템 3,6,9 기반으로 CCD를 사용하여 빛을 생산을 통해 감지 할 수를 표현 재조합 박테리아에 감염됩니다. 중요한 것은 단지 대사 활성 미생물은 가능한 박테리아 세포는이 방법 10,11으로 감지되는 의미 발광 (BL)입니다. 2D BLI, BL 소스의 위치를 사용하면 신호가 8 방출 동물의 표면에서 유추됩니다. 생체 내에서 BL 병소의 정확한 해부학 적 지역화는 달리 장기 3,6,9의 생체 분석을 통해 결정해야하며, 복합 3D 확산 광 영상 단층 촬영 (DLIT)는 BL의 양적 차원 재구성을 컴파일하는 데 사용할 수 있습니다 소스 12. DLIT이 촬영 BL 이미지를 수집하여 수행되는 정의 협 대역 통과 광 필터를 사용하여이후 확산 광 단층 촬영 3D 재구성 알고리즘 1,7,12,13에 그들을 입력.
현재 멀티 양상 이미징은 생체 분석을위한 필요없이 생체 발광 병소의 진정한 비 침습 해부학 적 지역화를 얻을 수있는 유일한 방법이다. 최근에, 우리는 DLIT의 조합 프로 바이오 틱 박테리아 7 예방 치료를 다음 Citrobacter rodentium (C. rodentium) 식민지 역학을 평가하는 μCT 이미징 공동 등록을 사용 하였다. C. rodentium는 enteropathogenic 및 enterhemorrhagic 대장균 14로 모델 인간의 감염에 사용되는 생쥐 특정 장내 병원균이다. C.는 rodentium 감염은 일반적으로 가벼운 체중 감소, 설사, 편광 살전 면역 반응과 대장 토굴 증식 등과 연결 별개의 병리학 적 변화 및 수축 단계 병변 formati과 관련된 대장염을 일으키는 원인이14. 이, C.에 추가 rodentium의 병인은 철저하게이 박테리아 멀티 모달 영상 3,4,7와 함께 사용하기위한 이상적인 모델 미생물하고 잘 문서화되어 C57BL/6J 마우스에 BLI과 식민지 역학을 사용하여 연구되었다.
이 프로토콜은 하나의 multimodality 이미징 플랫폼 IVIS 스펙트럼 CT, 비 침습적이 감염의 진정한 역학을 보여주는 4D 영화의 생성을 사용하여 세균 감염의 통합 DLIT-μCT 이미징을위한 방법을 설명하는 첫 번째입니다.
세균 감염의 4D 영화 멀티 양상 이미징 많은 양의 데이터를 신속하고 쉽게 시각화하고 해석 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 이 기술은 감염이 개인 마우스 퍼지는 방법에 대한 자세한 분석을 용이하게하고 조사 할 수있는 방법 호스트 또는 세균 유전자 또는 종단 연구 7시 특정 개입 전략의 효과 세균 하중, 배포 및 지역화 삭제. 이 동영상은 유용한 교육 보조 및 일반 대중에게 정보를 전파하는 수단을 제공합니다.
DLIT-μCT 이미징 및 감염의 4D 영상을 컴파일 할 수있는 능력에서 얻은 데이터의 품질에 영향을 미칠 수있는이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 C.와 생쥐의 성공과 동질 감염 rodentium. 이 연구에 사용 된 생쥐는 18-20그램 사이 그 것을 필수적이다 세균리얼 접종 갓 준비한 약 5 × 10 9 CFU는 앞에서 2,3 설명되어 있습니다. 이전 생쥐의 감염은 접종이 스펙트럼 CT를 사용하여 한 번 접종이 준비되어 발광 있는지 확인하는 것이 중요하다 각 마우스가 마우스 유사한 전염성 복용을받을 수 있도록하기 위해 gavaged되기 전에, 그것은 지속적으로 균질화해야합니다. 생쥐의 DLIT – μCT 영상은 생활 이미지 4.3.1 소프트웨어의 자동 노출 기능이 자동으로 잘 잡음보다 될 수있는 신호 최적화 된 이미지 매개 변수를 결정하도록 최적화되었습니다. 그러나, 자동 노출 기능이 절차에 설명 된대로 수정해야 할 사용자 정의 된 설정과 매개 변수에 의존합니다. 이렇게하지 않으면 자동 노출에 대한 스펙트럼 CT의 초기 설정은 영상 종양 표현하기위한 프로그램이기 때문에, 감염 명백한 진행이 발생하지 않는 수집 광자의 낮은 숫자로 빈약 한 이미지를 얻을 수 있습니다반딧불 루시 페라. 복원은 560-620 nm의 따라서, 재건에 포함 할 더 신뢰할 수있는 데이터가 있으며, 시뮬레이션 및 측정 된 데이터의 최적 계약을주고 사용하여 수행.
DLIT-μCT의 사용 제한은 μCT 검사에서 해당 이온화 방사선이 종단 연구 18 세 이상 누적 치사량의 방사선 손상의 원인이됩니다. 치사량의 방사선 노출은 DNA의 손상 및 내부 장기 19 apoptosis를 유발 면역 반응을 약화 할 수 있습니다. 이온화 방사선에 대한 LD 30분의 50은 생쥐의 마우스 변형과 연령에 따라 5-7 Gy의 사이 18,20,21를 사용하는, 초과하는 경우 궁극적으로, 누적 치사량의 방사선 손상은 사망을 일으킬 수 있습니다. 무엇보다 중요한 원칙은 보수적으로 복용량을 추정하기 때문에 이온화 방사선 분자 손상의 일부는 치유 할 수 있지만, 일반적으로이 연구 계획을 차지하지 않습니다. 대신, 목표는 멀리 벨로 유지하는 것입니다가능한 유동이 제한 여전히 연구 목표를 달성하는 동안. 이 때문에 감염에 대한 정상적인 면역 반응이 연구에서 특히 중요합니다, 이미징, 및 형질 전환 동물을 면역 구성, 또는 심하게 감염된 사실의 주파수는 이온화 방사선에 더 민감 할 수 있습니다.
감염의 4D 영화를 생성하는 실험을 계획 할 때, 그것은 실험의 길이를 고려하는 것이 중요합니다, μCT의 수는 사용중인 마우스의 변형에 대한 전리 방사선이 기간 동안 필요한 검사와 LD 30분의 50. 이 세균 검출 한계 및 이미징 시간에 영향을 미치기 때문에 DLIT-μCT에 또 다른 잠재적 인 제한은, 사용되는 균주에서 기자 식의 힘입니다. BLI 이전에 알 수 있듯이 그것은 매우 연구자가 완전히 악성이다 균주를 검증 사용하는 것이 좋습니다,하지만 최대 럭스 오페론 발현에 최적화되어 있습니다2,3.
4D 영상의 현재 디자인 한 가지주의 할 점은 각각의 영화가 다른 광자 스케일링이 개별 DLIT-μCT 검사로 구성되어 있다는 것입니다. BL 병소의 현지화, 또는 강도의 변화가 미세한 경우이 해석 할 이미지가 어려울 수 있습니다, 또는 여러 약한 병소에 의해 둘러싸인 하나의 강렬한 BL 초점이됩니다. 따라서 경도 시각화를 위해, 그것은 시점에 걸쳐 색 막대가 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.
감염의 4D 영화의 개념은 모든 적절한 표시 세균성 병원체에 적용 할 수 있습니다. 이 기술의 향후 발전 감염에 호스트 반응을 조사하는 적외선 프로브에 가까운 형광 발광 박테리아 병원균 주사의 조합을 사용하여 감염에 호스트 반응의 조사를 용이하게하기 위해 형광 이미징 단층 촬영 (FLIT)뿐만 아니라 DLIT를 사용하는 것을 목표로합니다. 또한이 방법이 프로토콜 우리는 단지감염의 4D 영화를 만들 수 발광 박테리아의 사용을 설명합니다. 그러나, 일부 경우에 그것은 생물 발광 기자가 감염 동안 호스트 유전학을 연구에 사용할 수 있도록 iRFP 태그 예를 들어, 형광 라벨 박테리아를 사용하는 것이 필요할 수 있습니다. 중요한 DLIT / FLIT-μCT을 결합 멀티 양상 이미징의 사용은 우리가 비 침습적 감소, 교양, 과학 연구에서 동물의 사용 대체에 크게 기여하는 세균성 감염 동안 여러 매개 변수를 조사 할 수 로 NC3R의 이니셔티브 (에 설명 http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
제국 대학 생체 내 이미징 시설에서는 MRC에 의해 투자되었다.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |