多模态成像是一种有价值的方法,在小动物模型研究细菌定植。此协议概述感染小鼠生物发光<em>柠檬酸rodentium</em和纵向监测细菌定植复合3D弥漫的光成像断层扫描成像μCT创建一个4D电影<em> C。 rodentium</em>感染。
此协议概述纵向监测的生物发光细菌感染,使用复合3D漫射光成像断层扫描集成μCT(μCTDLIT)和随后利用这些数据来生成一个四维(4D)电影感染周期所需的步骤。要发展感染4D电影和验证的μCTDLIT的使用IVIS频谱CT成像细菌感染的研究中,我们使用生物发光C.感染rodentium,这会导致自限性的小鼠结肠炎。在这个协议中,我们勾勒出感染小鼠生物发光C. rodentium和日常的μCTDLIT成像列举8天从粪便和细菌定植的非侵入性的监测。
的IVIS频谱CT的使用,有利于无缝配准的光学和μCT扫描,使用一个单一的成像平台。低剂量μCT方式使老鼠的摄像在感染过程中的多个时间点,提供详细的解剖定位,而不会造成文物的累积辐射生物发光细菌灶3D。更重要的是,受感染的小鼠的4D电影提供了一个功能强大的分析工具来监测体内的细菌定植动态。
小动物模型,特别是那些利用小鼠,常规用于研究细菌致病或测试感染,如抗生素,益生菌,益生元和疫苗1-7干预策略。主要实验小动物感染的病原体负荷读数,空间和时间的本地化的感染,受感染的机体的免疫反应, 在体内光学成像传染病研究的一个有价值的工具,可以用来监视多个实验通过使用读出的报告基因(荧光素酶,荧光蛋白,β-内酰胺酶,等),荧光染料,纳米颗粒或化学发光探针对象的蛋白质,生物过程或微生物6。
生物发光成像(BLI)是一种光学成像方式用于监视的小动物,如小鼠和大鼠的定植,致病bacteRIA 3,6,8,9。小鼠感染的重组细菌表达一个荧光素酶,如从发光光勒克斯 CDABE操纵子。这些细菌可以然后可以通过它们的光的生产,使用基于在体内成像系统3,6,9的CCD检测。重要的是,唯一的代谢活性的微生物是生物发光(BL),意思是唯一可行的被检测到的细菌细胞通过这种方法10,11。使用2D BLI,BL源的位置是推断,从动物的表面,其中的信号被发射8。确切的解剖定位在体内的BL灶,必须确定通过体外分析器官3,6,9相反,复合3D漫射光成像断层扫描(DLIT)可用于编译的定量三维重建的BL来源12。通过收集BL拍摄的图像进行DLIT使用定义的窄带通光学滤光器和随后输入到弥漫光断层扫描三维重建算法1,7,12,13。
目前,多模态成像是唯一的方法,可用于体外分析,而不需要得到真正的非侵入性的解剖定位在体内的生物发光灶。最近,我们使用的组合DLIT共同注册μCT成像评估枸橼酸杆菌rodentium(C. rodentium)定植动态预防性治疗益生菌7。C. rodentium是鼠科的特定的肠道病原体用于模型人类感染肠致病性和埃希氏 enterhemorrhagic的大肠杆菌14。C. rodentium感染引起的肠炎,通常伴有轻度减肥,腹泻,极化的Th1免疫反应和不同的病理变化,包括结肠隐窝增生和附加谦虚病变formati14。此外,C. rodentium发病已经彻底使用BLI和定植动态C57BL/6J小鼠是有据可查的,这种细菌的理想模型使用的多模态成像3,4,7微生物研究。
该协议是第一μCTDLIT集成使用一个多模态成像平台,IVIS频谱CT,和新一代的4D电影的真正动力的非侵入性感染的细菌感染成像勾勒出一个方法。
4D电影细菌感染提供了一个有用的工具,可视化和解释大量的多模态成像数据快速,轻松地。这种技术有助于详细分析了如何通过单个鼠标感染扩散,并可以用来研究如何删除主机或细菌基因或特定的干预策略效果细菌负荷,分销和本地化在一项纵向研究,7。这些影片也提供了有用的教具和向公众传播信息的一种手段。
有几个关键步骤,在这个协议中,可能会影响获得的数据从DLIT-μCT成像和能够编译感染的4D视频质量。在此协议中最重要的部分是成功的和均匀的感染与C小鼠, rodentium。至关重要的是,用于研究小鼠在18-20克之间,并且bacte里亚尔接种新鲜烹制的约5×10 9 CFU,如前所述2,3。小鼠感染之前,重要的是要检查,使用频谱CT,一旦已接种物制备接种物的生物发光,它必须不断地均质化之前,每只小鼠灌胃,以确保小鼠获得类似的感染剂量。老鼠的的μCTDLIT成像进行了优化,使自动曝光功能的生活图像4.3.1软件自动确定优化成像参数的信号要远高于噪声。然而,在自动曝光功能依赖于用户定义的设置和参数的程序中所描述的,这需要进行修改。如果不这样做会导致图像不佳,收集的光子数量较少,不会导致感染的一个明显的进展,作为频谱CT的出厂设置为自动曝光编程肿瘤成像表达萤火虫荧光素酶。重组使用560-620毫微米,得到最佳的模拟和测量数据之间的协议,因此,更可靠的数据包括在重建进行。
μCTDLIT使用的一个限制μCT扫描,电离辐射会导致亚致死辐射伤害是累积一项纵向研究,18。亚致死辐射暴露可能减弱免疫反应,引起DNA损伤,凋亡的内脏19。最终,累积亚致死辐射损伤可导致死亡的LD 50/30,如果超过电离辐射,这是在5至7之间戈瑞取决于小鼠品系和年龄的小鼠用18,20,21。虽然一些分子电离辐射损伤可以治愈,因为总体的原则是保守估计剂量,这是通常不占研究规划。相反,其目的是尽量留BEL嗷嗷这些限制可能,同时还完成了研究目标。这一点尤为重要,因为正常的免疫反应的感染在本研究中,可能会更容易电离辐射成像的频率,而事实上,转基因,免疫组成的,或严重感染的动物。
规划时,在实验过程中产生感染的4D电影时,重要的是要考虑实验的长度,在此期间要求μCT扫描的数量和LD 50/30的电离辐射所使用的小鼠品系。另一个潜在的限制到DLITμCT内的细菌菌株正在使用的记者表达的是实力,因为这会影响细菌的检出限和成像时间。强烈建议,研究人员使用经过验证是完全致命的细菌菌株,但最大的lux操纵子的表达进行了优化,证明以前BLI2,3。
当前设计的四维成像的一个需要注意的是,每部电影是由个别μCTDLIT的扫描有不同的光子缩放。这可以使图像难以解释的本地化的BL灶,其强度的变化是微妙的,如果有一个强烈的BL焦点周围由多个弱灶。因此,对于纵向的可视化,重要的是保持一致的时间点的彩条。
可以应用到任何适当标记的细菌病原体感染的4D电影的概念。这项技术的未来发展将致力于使用荧光成像断层扫描(FLIT)的以及DLIT的方便使用相结合的生物发光细菌病原体和荧光近红外探头调查感染的宿主反应注射感染的宿主反应的调查。除了这个,在这个协议中,我们只描述了使用生物发光的细菌感染创建4D电影。然而,在某些情况下,可能会需要使用荧光标记的细菌,例如用IRFP标签,所以可以用于调查在感染过程中的主机遗传学,生物发光记者。重要的是,使用的多模态成像结合DLIT /熔接μCT将让我们的非侵入性调查多个参数过程中的细菌感染,这将有助于显着减少,改进和更换使用动物在科研中列出的NC3R主动( http://www.nc3rs.org.uk/ )。
The authors have nothing to disclose.
在体内成像设施国子监的由MRC资助。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |