הדמיה רבת שיטה היא גישה יקרת ערך לחקר התישבות חיידקים במודלים של בעלי חיים קטנים. פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם bioluminescent<em> Citrobacter rodentium</em> והניטור האורך של התישבות חיידקים באמצעות טומוגרפיה ההדמיה האור המפוזרת 3D המורכבת עם μCT הדמיה כדי ליצור סרט 4D של<em> ג rodentium</em> זיהום.
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לפקח על זיהום חיידקי bioluminescent באמצעות טומוגרפיה מרוכבים 3D המפוזרת אור הדמיה עם μCT המשולב (DLIT-μCT) ולאחר מכן של שימוש בנתונים אלה כדי ליצור ארבעה סרט (4D) ממדי של מחזור זיהום longitudinally. כדי לפתח את סרטי 4D זיהום וכדי לאמת את ההדמיה DLIT-μCT ללימודי זיהום חיידקים באמצעות IVIS ספקטרום CT, השתמשנו בזיהום עם bioluminescent ג rodentium, הגורם לדלקת המעי הגס הגבלה עצמית בעכברים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הזיהום של עכברים עם bioluminescent ג rodentium וניטור בלתי פולשני של התישבות על ידי הדמיה DLIT-μCT יומית וספירת חיידקים מצואה במשך 8 ימים.
השימוש בספקטרום IVIS CT מאפשר שיתוף רישום חלק של סריקות אופטיות וμCT באמצעות פלטפורמת הדמיה בודדת. שיטת μCT המינון הנמוכה מאפשרת הדמיה של עכבריםבמספר רב של נקודות זמן במהלך זיהום, מתן לוקליזציה האנטומי מפורטת של מוקדי חיידקי bioluminescent ב3D מבלי לגרום לחפצים מהקרינה המצטברת. חשוב מכך, את סרטי 4D של עכברים נגועים לספק כלי אנליטי חזק כדי לפקח על דינמיקת קולוניזציה חיידקית in vivo.
מודלים של בעלי חיים קטנים, באותם עכברי ניצול מסוימים, משמשים באופן שגרתי כדי לחקור פתוגנזה חיידקים או לבחון אסטרטגיות התערבות לטיפול בדלקות, כגון אנטיביוטיקה, פרוביוטיקה, Prebiotics וחיסונים 1-7. את readouts הניסיוני העיקרי מזיהומים בבעלי החיים קטנים הם עומס הפתוגן, לוקליזציה מרחב ובזמן של הזיהום, ושינויים בתגובה החיסונית של האורגניזם הנגוע. בהדמיה אופטית vivo הוא כלי רב ערך למחקר מחלות מדבקות והוא יכול לשמש כדי לפקח על מספר רב של readouts ניסוי באמצעות השימוש בגני הכתב (חלבוני לוציפראז, ניאון, בטא lactamase, וכו '), צבעי ניאון, חלקיקים או בדיקות chemiluminescent ממוקדות לחלבון, תהליך ביולוגי, או מיקרואורגניזם 6.
הדמיה פליטת אור (BLI) היא שיטת הדמיה אופטית המשמשת לניטור קולוניזציה של בעלי חיים קטנים, כגון עכברים וחולדות, על ידי bacte פתוגנייםRIA 3,6,8,9. עכברים נגועים בחיידקים רקומביננטי המבטאים לוציפראז, כגון לוקס CDABE אופרון מluminescens Photorhabdus. לאחר מכן ניתן לאתר חיידקים אלה דרך הייצור שלהם באמצעות אור CCD מבוסס in vivo הדמיה מערכת 3,6,9. חשוב לציין, רק מיקרו אורגניזמים הפעילים מטבולית הם bioluminescent (BL), כלומר רק תאים חיידקיים קיימא מזוהים על ידי מתודולוגיה זו 10,11. שימוש 2D BLI, את מיקומו של מקור BL הוא להסיק את פני השטח של בעלי החיים שבו האות נפלט 8. הלוקליזציה האנטומי המדויקת של מוקדי BL in vivo צריכה להיקבע באמצעות ניתוח vivo לשעבר של איברים 3,6,9 לעומת זאת, מורכבת 3D מפוזר אור ההדמיה טומוגרפיה (DLIT) יכולה לשמש כדי לקמפל שחזור 3D כמותית של BL מקור 12. DLIT מבוצע על ידי איסוף תמונות שצולמו באמצעות מסנני BL להקה עוברות אופטיים צרים ומוגדריםלאחר מכן מזין אותם לתוך 3D אלגוריתם שיקום טומוגרפיה אופטי מפוזר 1,7,12,13.
נכון לעכשיו, הדמיה רבת שיטה היא השיטה היחידה העומדת למקבלת לוקליזציה האנטומי לא פולשנית אמיתית של bioluminescent מוקדי in vivo ללא צורך בניתוח vivo לשעבר. לאחרונה, השתמשנו בשילוב של DLIT שיתוף רשום עם μCT הדמיה כדי להעריך Citrobacter rodentium (ג rodentium) דינמיקת קולוניזציה בעקבות טיפול מניעתי עם חיידק הפרוביוטי 7. ג rodentium הוא פתוגן enteric ספציפי עכברי משמש להדבקת בני אדם עם מודל enteropathogenic וenterhemorrhagic חיידקי Escherichia 14. ג זיהום rodentium גורם דלקת המעי הגס, קשורות בדרך כלל עם הפסד מתון במשקל, שלשולים, תגובה חיסונית מקוטבת Th1 ושינויים פתולוגיים שונים, כוללים היפרפלזיה קריפטה הגס והצמדה והתבטלות הנגע formatiב -14. בנוסף לכך, ג פתוגנזה rodentium נחקרה ביסודיות באמצעות BLI ואת הדינמיקה שלה קולוניזציה בעכברי C57BL/6J מתועדת היטב, מה שהופך את החיידק זה מיקרואורגניזם מודל אידיאלי לשימוש עם רב שיטת הדמיה 3,4,7.
פרוטוקול זה הוא ראשון שמתאר מתודולוגיה להדמית DLIT-μCT המשולבת של זיהום חיידקים באמצעות פלטפורמה אחת multimodality הדמיה, IVIS ספקטרום ה-CT, והדור של סרט 4D מראה את הדינמיקה האמיתית של זיהום זה הלא פולשני.
סרט 4D של זיהום חיידקים מספק כלי שימושי כדי להמחיש ולפרש כמויות גדולות של נתונים הדמיה רבת אפנות במהירות ובקלות. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של איך זיהום מתפשט דרך עכבר בודד וניתן להשתמש בו כדי לחקור כיצד מחיקה של מארח או גנים של חיידקים או התערבות עומס חיידקים, הפצה, לוקליזציה והשפעת אסטרטגיות מסוימת במהלך מחקר אורך 7. סרטונים אלה מספקים גם עזרי הוראה שימושיים ואמצעי להפצת מידע לציבור.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה שיכול להשפיע על איכות הנתונים המתקבלים מהדמית DLIT-μCT והיכולת לקמפל וידאו 4D של זיהום. החלק החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא הזיהום המוצלח והומוגנית של עכברים עם ג rodentium. זה חיוני כי העכברים המשמשים למחקר הם בין 18-20 גרם ושbacteinoculums ריאל מוכן טרי וכ 5 X 10 9 CFU, כפי שתואר לעיל 2,3. לפני ההדבקה של העכברים חשוב לבדוק שהבידוד הוא bioluminescent באמצעות הספקטרום CT ופעם הבידוד כבר מוכן, הוא חייב להיות הומוגני הרף לפני כל עכבר gavaged על מנת להבטיח שהעכברים יקבלו מינוני זיהומיות דומים. ההדמיה DLIT-μCT של עכברים בצורה מיטבית, כך שפונקצית החשיפה האוטומטית בתוכנת 4.3.1 תמונת חיים קובעת באופן אוטומטי את הפרמטרים ההדמיה האופטימליים עבור האות להיות הרבה מעל לרעש. עם זאת, פונקצית החשיפה האוטומטית מסתמכת על הגדרות משתמש מוגדר ופרמטרים אשר צריכים להיות שונה, כמתואר בהליך. הימנעות מלעשות זאת תגרום לעניי תמונות עם מספר נמוך של פוטונים שנאסף ושאינם נובע בהתקדמות ברורה בזיהום, כהגדרות היצרן של הספקטרום CT לautoexposure מתוכנתות לגידולי הדמיה להביעגחלילית לוציפראז. שחזורים בוצעו באמצעות 560-620 ננומטר לתת את ההסכם הטוב ביותר בין הנתונים מדומים ומדודים, ולכן הם נתונים המהימנים יותר לכלול בבנייה מחדש.
הגבלה לשימוש בDLIT-μCT היא שהקרינה מייננת מסריקת μCT גורמת לניזקי קרינה תת קטלניים שהוא מצטבר על מחקר אורך 18. חשיפה לקרינה תת קטלנית יכולה להחליש את התגובה החיסונית, גורמת לניזק לדנ"א, ואפופטוזיס באיברים פנימיים 19. סופו של דבר, נזק קרינה תת קטלני מצטבר יכול לגרום למוות אם LD 50/30 לקרינה מייננת חריגה, אשר בין 5 עד 7 Gy בהתאם לזן העכבר וגיל של העכברים משמש 18,20,21. למרות שחלק מהניזקים מולקולריים מקרינה מייננת יכולים לרפא, שכן עיקרון העל הוא להעריך מינון שמרני, זה לא היווה בדרך כלל עבור בתכנון מחקר. במקום זאת, המטרה היא להישאר כמה שיותר רחוק בלow מגבלות אלה ככל האפשר ועדיין להשיג את מטרות המחקר. הדבר חשוב במיוחד במחקר זה בגלל התגובה החיסונית הנורמלית לזיהום, לתדירות של הדמיה, ואת העובדה כי מהונדס, חיסוני מורכב, או נגוע במידה רבה בעלי חיים עשויה להיות רגישה יותר לקרינה מייננת.
כאשר מתכננים ניסוי להפקת סרט 4D של זיהום, חשוב להביא בחשבון את אורכו של הניסוי, במספר μCT סורק נדרש בתקופה זו וLD 50/30 לקרינה מייננת לזן העכבר שבשימוש. מגבלה נוספת פוטנציאל DLIT-μCT היא כוח של הביטוי העיתונאי בזן החיידקים נמצאים בשימוש, כמו זה ישפיע מגבלות זיהוי חיידקים ושעות הדמיה. מומלץ מאוד שחוקרים משתמשים תוקף זני חיידקים שנמצאים באופן מלא ארסיים, אבל מותאם למקסימאלי לוקס אופרון ביטוי, כפי שהוכיח בעבר לBLI2,3.
אזהרה אחת לעיצוב הנוכחי של ההדמיה 4D היא שכל סרט מורכב מסריקות DLIT-μCT בודדות שיש להם קנה מידה פוטון שונה. זה יכול להפוך את התמונות קשה לפרש אם השינויים ללוקליזציה של מוקדי BL, או עוצמתו הם עדינים, או אם יש מוקד אחד אינטנסיבי BL מוקף במוקדים חלשים מרובים. לכן, עבור פריטים חזותיים אורכיים, חשוב לשמור על פסי הצבע עקביים בנקודתי הזמן.
הרעיון של סרט 4D של זיהום יכול להיות מיושם על כל מחולל מחלה חיידקית שכותרתו כראוי. פיתוח עתידי של טכניקה זו ישאף להשתמש דימות פלואורסצנטי טומוגרפיה (פליט), כמו גם כדי להקל על DLIT החקירה של תגובות מארחות לזיהום באמצעות שילוב של חיידקים פתוגנים bioluminescent וזריקות ניאון ליד בדיקות אינפרא אדום כדי לחקור את התגובות מארחות לזיהום. בנוסף לכך, בפרוטוקול זה אנו רקמתאר את השימוש של חיידקי bioluminescent ליצור סרטי 4D של זיהום. עם זאת, במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להשתמש בחיידקי שכותרת ניאון, למשל תויגו iRFP, כך שכתב פליטת אור יכול לשמש לחקר גנטיקה המארחת במהלך זיהום. חשוב מכך, השימוש בהדמיה רבת שיטת שילוב DLIT / פליט-μCT תאפשר לנו לחקור את הלא פולשני פרמטרים מרובים במהלך זיהום חיידקים, אשר יתרמו באופן משמעותי להפחתה, העידון, וההחלפה של השימוש בבעלי החיים במחקר מדעי כפי שמתואר ביוזמה של NC3R (http://www.nc3rs.org.uk/).
The authors have nothing to disclose.
במתקן ההדמיה vivo באימפריאל קולג' במומן על ידי MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |