Imagerie multi-modalité est une approche intéressante pour l'étude de la colonisation bactérienne dans les petits modèles animaux. Ce protocole décrit l'infection de souris avec bioluminescentes<em> Citrobacter rodentium</em> Et le suivi longitudinal de la colonisation bactérienne en utilisant composite diffuse la lumière tomographie d'imagerie 3D avec l'imagerie μCT pour créer un film 4D<em> C. rodentium</em> Infection.
Ce protocole décrit les étapes nécessaires à suivre longitudinalement une infection bactérienne bioluminescence utilisant la lumière composite tomographie d'imagerie diffuse 3D avec μCT intégré (DLIT-μCT) et l'utilisation ultérieure de ces données pour générer une dimensions (4D) film du cycle d'infection quatre. Pour développer les films d'infection 4D et de valider l'imagerie DLIT-μCT pour des études d'infection bactérienne à l'aide d'un spectre CT SIIV, nous avons utilisé l'infection par bioluminescence C. rodentium, ce qui provoque l'auto-limitation de la colite chez la souris. Dans ce protocole, nous décrivons l'infection de souris avec bioluminescente C. rodentium et la surveillance non invasive de la colonisation par le quotidien imagerie DLIT-μCT et le dénombrement des bactéries dans les excréments pendant 8 jours.
L'utilisation du spectre SIIV CT facilite la co-registration transparente des balayages optiques et μCT en utilisant une seule plate-forme d'imagerie. Le μCT modalité à faible dose permet l'imagerie de sourisà plusieurs moments au cours de l'infection, en fournissant la localisation anatomique détaillée de foyers bactérien de bioluminescence en 3D sans causer d'effets secondaires du rayonnement cumulatif. Surtout, les films 4D de souris infectées constituent un outil analytique puissant pour surveiller la dynamique de colonisation bactérienne in vivo.
Les petits modèles animaux, en particulier ceux des souris en utilisant, sont couramment utilisées pour étudier la pathogenèse bactérienne ou pour tester des stratégies d'intervention pour les infections, comme les antibiotiques, les probiotiques, les prébiotiques et les vaccins 1-7. Les principales lectures expérimentales de petites infections d'origine animale sont la charge de pathogènes, la localisation spatiale et temporelle de l'infection, et les changements de la réponse immunitaire de l'organisme infecté. Imagerie optique in vivo est un outil précieux pour la recherche sur les maladies infectieuses et peuvent être utilisés pour surveiller multiple lectures expérimentales grâce à l'utilisation de gènes rapporteurs (protéines fluorescentes, la luciférase, la bêta-lactamase, etc), des colorants fluorescents, des nanoparticules ou des sondes chimiluminescentes cible à une protéine, un processus biologique, ou d'un microorganisme 6.
l'imagerie par bioluminescence (BLI) est une modalité d'imagerie optique utilisé pour surveiller la colonisation de petits animaux comme les souris et les rats, par les bac pathogèneria 3,6,8,9. Les souris sont infectées par des bactéries recombinantes exprimant une luciférase, comme l'opéron lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Ces bactéries peuvent alors être détectés par leur production de lumière à l'aide d'un capteur CCD sur la base dans le système d'imagerie in vivo 3,6,9. Surtout, seuls les micro-organismes sont métaboliquement actifs bioluminescence (BL), ce qui signifie que des cellules bactériennes viables sont détectés par cette méthode 10,11. Utilisation 2D BLI, l'emplacement de la source BL est déduit à partir de la surface de l'animal, où le signal est émis 8. La localisation anatomique exacte de la BL foyers in vivo doit être déterminée par l'analyse ex vivo des organes 3,6,9 En revanche, composite 3D diffuse la lumière d'imagerie de tomographie (DLIT) peut être utilisée pour compiler une reconstruction 3D quantitative de la BL source 12. DLIT est effectuée par la collecte des images prises à l'aide BL-filtres optiques passe-bande étroits définis etensuite les entrer dans une tomographie optique 3D algorithme de reconstruction diffuse 1,7,12,13.
Actuellement, l'imagerie multi-modalité est la seule méthode disponible pour obtenir la vraie localisation anatomique non-invasive de foyers bioluminescence in vivo sans la nécessité d'une analyse ex vivo. Récemment, nous avons utilisé une combinaison de DLIT co-enregistré avec l'imagerie μCT pour évaluer Citrobacter rodentium (C. rodentium) Les dynamique de colonisation après le traitement prophylactique par une bactérie probiotique 7. C. rodentium est un agent pathogène entérique spécifique murin utilisé pour modéliser l'infection humaine par entéropathogènes et enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infection rodentium provoque la colite, généralement associée à une légère perte de poids, diarrhée, polarisée réponse immunitaire Th1 et les altérations pathologiques distincts, y compris l'hyperplasie des cryptes du côlon et attachant et effaçant lésion formatile 14. En plus de cela, C. pathogenèse de rodentium a été soigneusement étudiée par BLI et de sa dynamique de colonisation chez les souris C57BL/6J sont bien documentés, faisant de cette bactérie un modèle de micro-organisme idéal pour une utilisation avec la multi-modalité d'imagerie 3,4,7.
Ce protocole est le premier à décrire une méthodologie pour l'imagerie DLIT-μCT intégrée d'une infection bactérienne à l'aide d'une seule plate-forme multimodale d'imagerie, le SIIV Spectrum CT, et la génération d'un film 4D montrant la véritable dynamique de cette infection non invasive.
Le film 4D d'une infection bactérienne constitue un outil utile pour visualiser et interpréter de grandes quantités de données d'imagerie multi-modalité rapidement et facilement. Cette technique facilite l'analyse détaillée de la façon dont l'infection se propage par une souris individuelle et peut être utilisée pour étudier comment la suppression de l'hôte ou des gènes bactériens ou particulier stratégies d'intervention effet de la charge bactérienne, la distribution et la localisation au cours d'une étude longitudinale 7. Ces vidéos fournissent également des outils pédagogiques utiles et un moyen de diffuser l'information au public.
Il ya plusieurs étapes critiques dans ce protocole qui pourraient affecter la qualité des données obtenues par imagerie DLIT-μCT et la possibilité de compiler une vidéo 4D d'infection. La partie la plus importante de ce protocole est l'infection réussie et homogène de souris avec C. rodentium. Il est essentiel que les souris utilisées pour l'étude sont entre 18-20 g et que la bactéinoculums rial sont fraîchement préparés et environ 5 x 10 9 UFC, comme décrit précédemment 2,3. Avant d'infection des souris, il est important de vérifier que l'inoculum est bioluminescence utilisant le spectre CT et une fois l'inoculum a été préparé, il doit sans cesse être homogénéisé avant chaque souris est par gavage afin de s'assurer que les souris reçoivent des doses infectieuses similaires. L'imagerie DLIT-μCT de souris a été optimisé de sorte que la fonction d'exposition automatique dans le logiciel 4.3.1 image vivante détermine automatiquement les paramètres d'imagerie optimisés pour que le signal soit bien au-dessus du bruit. Cependant, la fonction d'exposition automatique s'appuie sur les paramètres et les paramètres définis par l'utilisateur qui doivent être modifiés comme décrit dans la procédure. Sinon, cela se traduira par des images pauvres avec un faible nombre de photons collectés qui ne donne pas lieu à une progression évidente dans l'infection, comme les réglages d'usine du spectre CT pour l'exposition automatique sont programmés pour l'imagerie des tumeurs exprimantluciférase de luciole. Reconstructions effectuées à l'aide de 560 à 620 nm donnent le meilleur accord entre les données simulées et mesurées et, par conséquent, les données plus fiables à inclure dans la reconstruction.
Une limitation de l'utilisation de DLIT-μCT est que le rayonnement ionisant à partir de l'analyse μCT provoque des dégâts d'irradiation sublétale qui est cumulative au cours d'une étude longitudinale 18. L'exposition aux radiations sub-létaux peut affaiblir la réponse immunitaire, provoquer des lésions de l'ADN et l'apoptose dans les organes internes 19. En fin de compte, dégâts d'irradiation sub-létale cumulatif peut entraîner la mort si le LD 50/30 pour les rayonnements ionisants est dépassé, ce qui est entre 5 et 7 Gy en fonction de la souche de souris et de l'âge des souris utilisé 18,20,21. Bien que certains des dommages moléculaires des rayonnements ionisants peut guérir, puisque le principe fondamental est d'estimer la dose prudente, ce n'est généralement pas pris en compte dans la planification de l'étude. Au lieu de cela, l'objectif est de rester le plus belux de ces limites que possible tout en réalisant les objectifs de l'étude. Ceci est particulièrement important dans cette étude en raison de la réponse immunitaire normale à l'infection, la fréquence de l'imagerie, et le fait que transgénique, immuno-composé, ou fortement animaux infectés peuvent être plus sensibles aux rayonnements ionisants.
Lors de la planification de l'expérience pour produire un film 4D d'infection, il est important de considérer la durée de l'expérience, le nombre de μCT analyse requis au cours de cette période et la LD 50/30 pour les rayonnements ionisants pour la souche de souris utilisée. Une autre limite potentielle à DLIT-μCT est la force de l'expression de journaliste au sein de la souche bactérienne utilisée, car cela aura une incidence sur les limites de détection bactérienne et heures d'imagerie. Il est fortement recommandé que les chercheurs utilisent validés souches bactériennes qui sont très virulents, mais optimisée pour lux expression de l'opéron maximal, comme l'a montré précédemment pour BLI2,3.
Une mise en garde à la conception actuelle de l'imagerie 4D est que chaque film est composé de scans DLIT-μCT individuels qui ont différente échelle photon. Cela peut rendre les images difficiles à interpréter si les modifications apportées à la localisation de la BL foyers, ou son intensité sont subtiles, ou si il ya un accent BL intense entouré de multiples foyers faible. Par conséquent, pour les visualisations longitudinales, il est important de garder les barres de couleur uniforme dans les points dans le temps.
Le concept d'un film 4D d'infection peut être appliquée à n'importe quel agent pathogène bactérien convenablement étiqueté. Le développement futur de cette technique vise à utiliser l'imagerie par fluorescence tomography (EIPC) ainsi que DLIT pour faciliter l'enquête de réponses de l'hôte à l'infection en utilisant une combinaison d'agents pathogènes bactériens bioluminescentes et injectables fluorescentes près de sondes infrarouges pour enquêter sur les réponses de l'hôte à l'infection. En plus de cela, dans ce protocole, nous nedécrire l'utilisation de bactéries bioluminescentes pour créer des films 4D d'infection. Toutefois, dans certains cas, il peut être nécessaire d'utiliser des bactéries marquées par fluorescence, par exemple étiquetés avec IRFP, de sorte que le journaliste de bioluminescence peut être utilisé pour l'étude génétique de l'hôte lors de l'infection. Surtout, l'utilisation de l'imagerie multi-modalité combinant DLIT / FLIT-μCT va nous permettre d'enquêter de manière non invasive des paramètres multiples au cours d'une infection bactérienne, ce qui contribuera de manière significative à la réduction, raffinement, et le remplacement de l'utilisation des animaux dans la recherche scientifique comme indiqué dans l'initiative de la NC3R ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
L'installation dans d'imagerie in vivo à l'Imperial College a été financé par la MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |