Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met bioluminescente<em> Citrobacter rodentium</em> En de longitudinale monitoring van bacteriële kolonisatie met composiet 3D diffuus licht beeldvorming tomografie met μCT beeldvorming om een 4D-film van te maken<em> C. rodentium</em> Infectie.
Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om longitudinaal monitoren een bioluminescerend bacteriële infectie met behulp van composiet 3D diffuus licht beeldvorming tomografie met geïntegreerde μCT (DLIT-μCT) en het latere gebruik van deze gegevens om een vierdimensionale (4D) filmpje van de infectie cyclus te genereren. Om de 4D infectie films te ontwikkelen en de DLIT-μCT beeldvorming voor bacteriële infectie studies met behulp van een IVIS Spectrum CT valideren, gebruikten we een infectie met lichtgevende C. rodentium, die zelfbeperkende colitis bij muizen veroorzaakt. In dit protocol, schetsen we de infectie van muizen met lichtgevende C. rodentium en niet-invasieve bewaking van kolonisatie door dagelijkse DLIT-μCT imaging en bacteriële telling van feces gedurende 8 dagen.
Het gebruik van de IVIS Spectrum CT vergemakkelijkt naadloze co-registratie van optische en μCT scans met behulp van een enkel imaging platform. De lage dosis μCT modaliteit maakt de beeldvorming van muizenOp verschillende tijdstippen tijdens infectie, het verstrekken van gedetailleerde anatomische lokalisatie van lichtgevende bacteriën brandpunten in 3D zonder dat artefacten uit de cumulatieve straling. Belangrijk is dat de 4D films van geïnfecteerde muizen bieden een krachtige analytische tool om bacteriële kolonisatie dynamiek volgen in vivo.
Kleine diermodellen, met name het gebruik van muizen, worden routinematig gebruikt om bacteriële pathogenese onderzoeken of interventiestrategieën testen op infecties, zoals antibiotica, probiotica, prebiotica en vaccins 1-7. De belangrijkste experimentele uitlezingen van kleine dieren infecties pathogenen, ruimtelijke en temporele lokalisatie van de infectie, en veranderingen in de immuunrespons van het geïnfecteerde organisme. In vivo optische beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor infectieziekten en kan worden gebruikt voor het monitoren meerdere experimentele uitlezingen door het gebruik van reportergenen (luciferase, fluorescent eiwit, beta-lactamase, enz.), fluorescente kleurstoffen, nanodeeltjes of chemiluminescente probes gericht op een eiwit biologisch proces of micro-organisme 6.
Bioluminescentie (BLI) is een optisch beeldvormende modaliteit gebruikt om de kolonisatie van kleine dieren, zoals muizen en ratten controleren door pathogene bacria 3,6,8,9. Muizen geïnfecteerd met recombinant bacteriën een luciferase expressie, zoals het lux operon CDABE van Photorhabdus luminescens. Deze bacteriën kunnen vervolgens worden gedetecteerd door de productie van licht met een CCD gevestigd in vivo imaging systeem 3,6,9. Belangrijk is alleen metabool actieve micro-organismen bioluminescerende (BL), waardoor alleen levensvatbare bacteriële cellen worden gemeten door deze methode 10,11. Gebruik 2D BLI, de locatie van de BL bron wordt afgeleid uit het oppervlak van het dier wanneer het signaal wordt uitgezonden 8. De exacte anatomische lokalisatie van de BL foci in vivo moet worden bepaald door ex vivo analyse van 3,6,9 organen kunnen daarentegen samengestelde 3D diffuus licht imaging tomografie (DLIT) worden gebruikt om een kwantitatieve 3D reconstructie van de BL samenstellen bron 12. DLIT wordt uitgevoerd door het verzamelen van BL beelden zijn gemaakt met behulp gedefinieerd smalle band-pass optische filters enze vervolgens invoeren in een diffuse optische tomografie 3D reconstructie-algoritme 1,7,12,13.
Momenteel, multi-modaliteit beeldvorming is de enige methode beschikbaar true non-invasieve anatomische lokalisatie van bioluminescent foci in vivo krijgen zonder dat ex vivo analyse. Onlangs, hebben we gebruik gemaakt van een combinatie van DLIT co-ingeschreven bij μCT beeldvorming om Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisatie dynamiek evalueren na profylactische behandeling met een probioticum bacterie 7. C. rodentium is een muizen specifiek darmpathogeen gebruikt om het model menselijke besmetting met enteropathogene en enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium infectie veroorzaakt colitis, doorgaans geassocieerd met milde gewichtsverlies, diarree, gepolariseerde Th1 immuunrespons en duidelijke pathologische veranderingen, waaronder dikke crypte hyperplasie en vastmaken en uitwissen laesie formatiop 14. Naast deze, C. rodentium pathogenese is grondig bestudeerd met behulp van BLI en de kolonisatie dynamiek in C57BL/6J-muizen zijn goed gedocumenteerd, waardoor deze bacterie een ideaal model organisme voor gebruik met multi-modaliteit beeldvorming 3,4,7.
Dit protocol is de eerste van een methodologie voor geïntegreerde DLIT-μCT beeldvorming van een bacteriële infectie met behulp van een multimodale beeldvorming platform, de IVIS Spectrum CT, en het genereren van een 4D-film toont de ware dynamiek van deze infectie niet-invasief schetsen.
De 4D film van een bacteriële infectie een nuttig hulpmiddel om grote hoeveelheden van multi-modaliteit beeldvorming gegevens snel en gemakkelijk visualiseren en interpreteren. Deze techniek maakt een gedetailleerde analyse van hoe een infectie verspreidt een individuele muis kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe deletie van gastheer of bacteriële genen of bijzondere interventiestrategieën effect bacteriële belasting, distributie en lokalisatie in een longitudinale studie 7. Deze video's geven ook nuttig leermiddelen en een middel van het verspreiden van informatie aan het publiek.
Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol kunnen hebben voor de kwaliteit van de gegevens van DLIT-μCT beeldvorming en de mogelijkheid om een 4D video infectie stellen. Het belangrijkste onderdeel van dit protocol is de succesvolle en homogene infectie van muizen met C. rodentium. Het is essentieel dat de muizen gebruikt voor de studie tussen 18-20 g en dat de bacrial inoculums worden vers bereid en ongeveer 5 x 10 9 cfu, zoals eerder beschreven 2,3. Voorafgaand aan infectie van de muizen is het belangrijk om te controleren dat het inoculum is bioluminescent met de Spectrum CT en zodra het inoculum is opgesteld, moet het voortdurend worden gehomogeniseerd elke muis wordt gavaged zodat de muizen op vergelijkbare infectieuze doses. De DLIT-μCT beeldvorming van muizen is geoptimaliseerd zodat de functie Automatische belichting in Living Afbeelding 4.3.1 software bepaalt automatisch de geoptimaliseerde beeldvorming parameters voor het signaal om goed boven het lawaai. De functie automatische belichting voert de gebruiker gedefinieerde instellingen en parameters die moeten worden gemodificeerd zoals beschreven in de procedure. Doet u dit niet zal resulteren in slechte beelden met een lage aantal fotonen verzameld die niet resulteren in een duidelijke progressie in de infectie, als de fabrieksinstellingen van de Spectrum CT voor automatische belichting zijn geprogrammeerd voor imaging tumoren dievuurvliegluciferase. Reconstructies uitgevoerd met 560-620 nm de beste overeenkomst tussen gesimuleerde en gemeten data en dus zijn de meer betrouwbare gegevens om in de reconstructie.
Een beperking van het gebruik van DLIT-μCT is dat ioniserende straling van de μCT scan veroorzaakt sublethale bestraling schade die cumulatief in een longitudinale studie 18. Subletaal blootstelling aan straling kan de immuunrespons verzwakken, leiden tot DNA-schade en apoptose in interne organen 19. Uiteindelijk kan cumulatief subletale stralingsschade dood veroorzaken als de LD 50/30 van ioniserende straling wordt overschreden, die tussen 5-7 Gy naargelang de muis stam en leeftijd van de muizen gebruikt 18,20,21. Hoewel sommige van de moleculaire schade als gevolg van ioniserende straling kan genezen, omdat het overkoepelende principe is om dosis conservatief schatten, wordt dit meestal niet verantwoord in studieplanning. Integendeel, de bedoeling is om te verblijven zoveel below deze grenzen mogelijk terwijl nog steeds het realiseren van de leerdoelen. Dit is vooral belangrijk bij dit onderzoek door de normale immuunrespons op de infectie, kan de frequentie van de beeldvorming en het feit dat transgene, immuno-bestaande of zwaar geïnfecteerde dieren gevoeliger voor ioniserende straling.
Bij het plannen van het experiment een 4D film infectie genereren, is het belangrijk de lengte van het experiment beschouwen, het aantal scans μCT vereist tijdens deze periode en de LD 50/30 van ioniserende straling voor de muis stam gebruikt. Een andere mogelijke beperking tot DLIT-μCT is de kracht van de reporter uitdrukking binnen de bacteriestam wordt gebruikt, omdat dit van invloed op bacteriële detectielimieten en imaging keer. Het is sterk aanbevolen dat de onderzoekers gebruiken gevalideerde bacteriestammen die volledig virulent, maar geoptimaliseerd voor maximale lux operon meningsuiting, zoals eerder aangetoond voor BLI2,3.
Een waarschuwing aan het huidige ontwerp van de 4D beeldvorming is dat elke film bestaat uit afzonderlijke DLIT-μCT scans die verschillende foton schalen hebben. Dit kan de beelden moeilijk te interpreteren maken als de wijzigingen in de lokalisatie van de BL brandpunten, of de intensiteit zijn subtiel, of als er een intense BL focus, omringd door meerdere zwakke foci. Daarom is voor longitudinale visualisaties, is het belangrijk de kleurenbalken consistent houden over de tijdstippen.
Het begrip 4D film infectie kan worden toegepast op elke geschikte wijze gemerkte bacteriële pathogenen. Toekomstige ontwikkeling van deze techniek zal streven naar fluorescentiebeelvorming tomografie (FLIT) alsook DLIT gebruiken om het onderzoek van gastheer reacties op infectie met behulp van een combinatie van bioluminescentie bacteriële pathogenen en injecteerbare fluorescerende nabij infrarood sensoren om gastheer responsen te onderzoeken om infectie te vergemakkelijken. In aanvulling op deze, alleen in dit protocol hebben webeschrijven het gebruik van bioluminescente bacteriën 4D films infectie creëren. Echter, in sommige gevallen noodzakelijk om fluorescent gemerkte bacteriën gebruiken kunnen bijvoorbeeld gelabeld met IRFP, zodat de bioluminescente reportergen kan worden gebruikt voor het onderzoeken van genetica van tijdens infectie. Belangrijk is, zal het gebruik van multi-modaliteit beeldvorming combineert DLIT / FLIT-μCT ons toelaten om meerdere parameters niet-invasieve onderzoeken van een bacteriële infectie, die aanzienlijk zal bijdragen tot de vermindering, verfijning en vervanging van het gebruik van dieren bij wetenschappelijk onderzoek zoals uiteengezet in het initiatief van de NC3R's ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
De in vivo imaging faciliteit aan het Imperial College werd gefinancierd door het MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |