التصوير المتعدد طريقة هو نهج قيمة لدراسة الاستعمار الجرثومي في نماذج حيوانية صغيرة. هذا البروتوكول يحدد إصابة الفئران مع إضاءة الحيوية<em> الليمونية rodentium</em> ورصد الطولي للاستعمار الجرثومي باستخدام مركب ضوء منتشر 3D التصوير المقطعي التصوير مع μCT التصوير لخلق فيلم 4D من<em> C. rodentium</em> عدوى.
يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لرصد طوليا عدوى بكتيرية إضاءة الحيوية باستخدام مركب ضوء منتشر 3D التصوير المقطعي التصوير مع متكامل μCT (DLIT-μCT) واستخدام لاحقة من هذه البيانات لتوليد الأبعاد (4D) فيلم أربعة من دورة العدوى. لتطوير الأفلام عدوى 4D وللتحقق من صحة التصوير DLIT-μCT للدراسات عدوى بكتيرية باستخدام IVIS الطيف CT، كنا العدوى مع إضاءة الحيوية C. rodentium، والذي يسبب محدودة ذاتيا التهاب القولون في الفئران. في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة إصابة الفئران مع إضاءة الحيوية C. rodentium ورصد غير الغازية من الاستعمار يوميا التصوير DLIT-μCT وتعداد بكتيريا من البراز لمدة 8 أيام.
استخدام الطيف IVIS CT يسهل سلس المشارك التسجيل من بالاشعة الضوئية وμCT باستخدام منصة التصوير واحد. انخفاض جرعة طريقة μCT تمكن التصوير من الفئرانفي نقاط زمنية متعددة خلال العدوى، وتوفير توطين تشريحية مفصلة من البؤر الجرثومية إضاءة الحيوية في 3D دون التسبب في الأعمال الفنية من الإشعاع التراكمي. الأهم من ذلك أن الأفلام 4D من الفئران المصابة توفير أداة تحليلية قوية لرصد ديناميات الاستعمار الجرثومي في الجسم الحي.
النماذج الحيوانية الصغيرة، ولا سيما تلك التي تستخدم الفئران، وتستخدم بشكل روتيني للتحقيق المرضية البكتيرية أو لاختبار استراتيجيات التدخل للعدوى، مثل المضادات الحيوية، البروبيوتيك، البريبايوتكس واللقاحات 1-7. لقراءات تجريبية الرئيسي من الإصابات الحيوانية الصغيرة هي الحمل الممرض، توطين المكاني والزماني للعدوى، وتغييرات على الاستجابة المناعية للكائن مصاب. في الجسم الحي التصوير الضوئي هو أداة قيمة لبحوث أمراض المعدية، ويمكن استخدامها لمراقبة متعددة قراءات تجريبية من خلال استخدام جينات مراسل (البروتينات وسيفيراز، فلوري، بيتا اكتاماز، الخ)، والأصباغ الفلورية، النانوية أو تحقيقات chemiluminescent تستهدف بروتين، عملية بيولوجية، أو الكائنات الحية الدقيقة 6.
التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) هو طريقة التصوير الضوئية المستخدمة لرصد الاستعمار من الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران والجرذان، من قبل البكتيريا المسببة للأمراضريا 3،6،8،9. يصاب الفئران مع البكتيريا المؤتلف معربا عن وسيفيراز، مثل لوكس CDABE الاوبرون من luminescens Photorhabdus. ثم يمكن الكشف عن هذه البكتيريا من خلال إنتاجها باستخدام ضوء CCD مقرها في الجسم الحي نظام التصوير 3،6،9. الأهم من ذلك، فقط الكائنات الحية الدقيقة الفعالة عملية الأيض هي إضاءة الحيوية (BL)، وهذا يعني تم الكشف عن الخلايا البكتيرية فقط قابلة للحياة عن طريق هذه المنهجية 10،11. باستخدام 2D BLI، موقع المصدر BL يستدل من سطح الحيوان حيث ينبعث إشارة 8. توطين التشريحية الدقيقة للبؤر BL في الجسم الحي لابد من تحديدها من خلال تحليل فيفو السابقين من الأجهزة 3،6،9 وفي المقابل، مركب ضوء منتشر 3D التصوير المقطعي (DLIT) يمكن استخدامها لتجميع إعادة الإعمار 3D الكمي للBL مصدر 12. يتم تنفيذ DLIT من خلال جمع الصور التي يتم التقاطها باستخدام BL المرشحات الضوئية تعريف الفرقة تمرير الضيقة وإدخال في وقت لاحق لهم في منتشر البصرية التصوير المقطعي 3D إعادة الإعمار الخوارزمية 1،7،12،13.
حاليا، التصوير متعدد طريقة هي المنهجية الوحيدة المتاحة للحصول صحيح توطين التشريحية غير الغازية من بؤر إضاءة الحيوية في الجسم الحي دون الحاجة إلى تحليل فيفو السابقين. في الآونة الأخيرة، كنا مجموعة من DLIT المشترك مسجل لدى μCT التصوير لتقييم الليمونية rodentium (C. rodentium) ديناميات الاستعمار بعد العلاج الوقائي مع بكتيريا بروبيوتيك 7. C. rodentium هو الممرض المعوية محددة الفئران تستخدم لعدوى الإنسان نموذج مع ممرض للأمعاء وenterhemorrhagic كولاى 14. C. عدوى rodentium تسبب التهاب القولون الغشائي، التي ترتبط عادة مع معتدل فقدان الوزن والاسهال والاستقطاب TH1 الاستجابة المناعية والتغيرات المرضية متميزة، بما في ذلك القولون تضخم سرداب وربط والأضواء الآفة formatiفي 14. بالإضافة إلى هذا، C. وقد المرضية rodentium درس بعناية باستخدام BLI وديناميات الاستعمار في الفئران C57BL/6J موثقة توثيقا جيدا، مما يجعل هذه البكتيريا والكائنات الحية الدقيقة نموذج مثالي للاستخدام مع متعددة طريقة التصوير 3،4،7.
هذا البروتوكول هو أول من الخطوط العريضة لمنهجية للتصوير DLIT-μCT متكاملة من عدوى بكتيرية باستخدام منصة واحدة تعدد الوسائط والتصوير، وIVIS الطيف CT، وتوليد فيلم 4D تظهر ديناميات الحقيقية لهذه العدوى غير جراحية.
و4D فيلم من عدوى بكتيرية يوفر أداة مفيدة لتصور وتفسير كميات كبيرة من البيانات التصوير متعدد الطريقة بسرعة وسهولة. هذه التقنية تسهل تحليل مفصل لكيفية انتشار العدوى من خلال الماوس الفردية، ويمكن استخدامها للتحقيق في كيفية حذف المضيفة أو الجينات البكتيرية أو خاصة تدخل استراتيجيات تأثير الحمولة الجرثومية، والتوزيع، وتوطين خلال دراسة طولية 7. كما تقدم أشرطة الفيديو هذه الوسائل التعليمية المفيدة وسيلة لنشر المعلومات للجمهور.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول، ويمكن أن تؤثر على نوعية البيانات التي تم الحصول عليها من DLIT-μCT التصوير والقدرة على تجميع الفيديو 4D من العدوى. أهم جزء من هذا البروتوكول هو عدوى ناجحة ومتجانسة من الفئران مع C. rodentium. فمن الضروري أن الفئران المستخدمة في الدراسة هي بين 18-20 غرام وأن البكتيرياوأعدت طازجة قيحة ريال وحوالي 5 × 10 9 كفو، كما هو موضح سابقا 2،3. قبل العدوى من الفئران من المهم للتأكد من أن اللقاح هو إضاءة الحيوية باستخدام الطيف CT ومرة واحدة وقد تم إعداد اللقاح، فإنه يجب المتجانس باستمرار قبل gavaged كل فأر لضمان أن الفئران تلقي جرعات المعدية مماثلة. وقد تم تحسين التصوير DLIT-μCT من الفئران بحيث تكون وظيفة تعرض السيارات في الجلوس صورة 4.3.1 برنامج يحدد تلقائيا المعلمات التصوير الأمثل للإشارة إلى أن تكون أعلى بكثير من الضجيج. ومع ذلك، يعتمد وظيفة تعرض السيارات على إعدادات يحددها المستخدم والمعلمات التي تحتاج إلى تعديل كما هو موضح في الإجراء. والفشل في القيام بذلك يؤدي في صور الفقراء مع عدد قليل من الفوتونات التي تم جمعها والتي لا تؤدي إلى تقدم واضح في الإصابة، كما تمت برمجة إعدادات المصنع الطيف CT للautoexposure للأورام التصوير معربا عنluciferase يراعة. إجراء عمليات إعادة البناء باستخدام 560-620 نانومتر تقديم أفضل اتفاق بين بيانات محاكاة ومحسوبة، وبالتالي، هي أكثر موثوقية البيانات أن تدرج في إعادة الإعمار.
وجود قيود على استخدام DLIT-μCT هو أن الإشعاع المؤين من الفحص μCT يسبب أضرار الإشعاع شبه القاتلة التي هي عملية تراكمية خلال دراسة طولية 18. يمكن التعرض للإشعاع المميتة دون إضعاف الاستجابة المناعية، وتسبب التلف في الحمض النووي، وموت الخلايا المبرمج في الأعضاء الداخلية 19. في نهاية المطاف، يمكن التراكمي أضرار الإشعاع شبه قاتلة تتسبب في وفاة إذا كانت الجرعة المميتة، 50/30 الإشعاعات المؤينة يتم تجاوز، وهي تتراوح بين 5 إلى 7 جراى اعتمادا على سلالة الماوس وعمر الفئران المستخدمة 18،20،21. على الرغم من بعض الضرر الجزيئية من الإشعاع المؤين يمكن أن يشفي، لأن المبدأ الأساسي هو تقدير متحفظ جرعة، وهذا ما لا تحتسب عادة لفي تخطيط الدراسة. بدلا من ذلك، فإن الهدف هو البقاء بقدر بيلآه هذه الحدود ممكن في حين لا يزال تحقيق أهداف الدراسة. هذا مهم بشكل خاص في هذه الدراسة بسبب الاستجابة المناعية الطبيعية للعدوى، قد تردد من التصوير، وحقيقة أن المعدلة وراثيا، والمناعية تتكون، أو الحيوانات المصابة بشدة أن تكون أكثر عرضة للإشعاع المؤين.
عند التخطيط للتجربة لتوليد فيلم 4D من العدوى، فمن المهم النظر في طول التجربة، وعدد من μCT بمسح المطلوبة خلال هذه الفترة وLD 50/30 للإشعاع المؤين للسلالة الماوس المستخدمة. آخر قيود المحتملة لDLIT-μCT هو قوة التعبير مراسل داخل السلالة البكتيرية المستخدمة، لأن هذا سوف يؤثر حدود الكشف البكتيرية وأوقات التصوير. فمن المستحسن جدا أن باحثين استخدام التحقق من صحة السلالات البكتيرية التي هي خبيثة تماما، ولكن الأمثل لالقصوى لوكس الاوبرون التعبير، كما هو موضح سابقا لBLI2،3.
التحذير واحدة إلى التصميم الحالي لل4D التصوير هو أن كل فيلم تتألف من فرد بالاشعة DLIT-μCT التي لها توسيع نطاق الفوتون مختلفة. هذا يمكن أن تجعل من الصعب تفسير الصور إذا التغييرات إلى توطين BL البؤر، أو شدته خفية، أو إذا كان هناك واحدة مكثفة BL التركيز تحيط بها عدة بؤر ضعيفة. لذلك، لتصورات طولية، فمن المهم للحفاظ على لون القضبان متناسقة عبر نقاط زمنية.
ويمكن تطبيق مفهوم فيلم 4D العدوى إلى أي الممرض الجرثومي المسمى بشكل مناسب. سوف التنمية المستقبلية لهذه التقنية تهدف إلى استخدام التصوير المقطعي مضان (فليت) وكذلك DLIT لتسهيل التحقيق في الاستجابات المضيفة للإصابة باستخدام مزيج من مسببات الأمراض البكتيرية إضاءة الحيوية والحقن الفلورسنت بالقرب من الأشعة تحت الحمراء تحقيقات للتحقيق استجابات المضيف للإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا البروتوكول ونحن فقطوصف استخدام البكتيريا إضاءة الحيوية لخلق أفلام 4D من العدوى. ومع ذلك، في بعض الحالات قد يكون من الضروري استخدام الفلورسنت البكتيريا المسمى، على سبيل المثال المفتاحية iRFP، بحيث مراسل تلألؤ بيولوجي يمكن استخدامها للتحقيق في علم الوراثة المضيف خلال العدوى. الأهم من ذلك، فإن استخدام التصوير متعدد طريقة الجمع بين DLIT / فليت-μCT تسمح لنا للتحقيق غير جراحية معلمات متعددة أثناء العدوى البكتيرية، والتي سوف تساهم بشكل كبير في الحد، والصقل، واستبدال استخدام الحيوانات في البحوث العلمية على النحو المبين في مبادرة NC3R لل( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
ومرفق في التصوير المجراة في امبريال كوليدج تم تمويله من قبل لجنة نهر الميكونج.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |