De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com bioluminescente<em> Citrobacter rodentium</em> Eo acompanhamento longitudinal de colonização bacteriana usando luz difusa tomografia 3D composto com μCT imagens para criar um filme 4D de<em> C. rodentium</em> Infecção.
Este protocolo descreve os passos necessários para monitorar longitudinalmente uma infecção bacteriana bioluminescente utilizando luz difusa tomografia composto 3D integrado com μCT (DLIT-μCT) ea posterior utilização dos dados para gerar um filme de quatro dimensional (4D) do ciclo de infecção. Para desenvolver os filmes de infecção 4D e para validar a imagem DLIT-μCT para estudos de infecção bacteriana utilizando um IVIS Spectrum CT, usamos a infecção com bioluminescente C. rodentium, o que faz com que a auto-limitante colite em ratos. Neste protocolo, descrevemos a infecção de camundongos com bioluminescente C. rodentium e monitoramento não-invasivo da colonização por diária de imagens DLIT-μCT e enumeração de bactérias das fezes para 8 dias.
O uso do IVIS Spectrum CT facilita perfeita co-registo de exames ópticos e μCT utilizando uma plataforma de imagem única. A baixa modalidade μCT doses permite a imagem dos camundongosem vários momentos durante a infecção, oferecendo localização anatômica detalhada dos focos de bactérias bioluminescentes em 3D sem causar artefatos da radiação cumulativa. É importante ressaltar que os filmes 4D de camundongos infectados fornecer uma poderosa ferramenta analítica para monitorar a dinâmica de colonização de bactérias in vivo.
Modelos de pequenos animais, em especial os que utilizam ratos, são rotineiramente utilizados para investigar patogênese bacteriana ou para testar estratégias de intervenção para infecções, tais como antibióticos, probióticos, prebióticos e vacinas 1-7. As principais leituras experimentais de infecções animais pequenos são carga de patógenos, localização espacial e temporal da infecção, e alterações na resposta imunológica do organismo infectado. Em imagiologia óptica in vivo é uma ferramenta valiosa para a pesquisa de doenças infecciosas e pode ser utilizado para monitorizar múltiplas Leituras experimentais, através da utilização de genes repórteres (proteínas fluorescentes, luciferase, beta-lactamase, etc), corantes fluorescentes, nanopartículas ou sondas quimioluminescentes apontado a um processo biológico da proteína, ou microrganismo 6.
Imagem de bioluminescência (BLI) é uma modalidade de imagiologia óptica utilizado para monitorar a colonização de pequenos animais, tais como ratinhos e ratos, por bactericida patogénicaria 3,6,8,9. Os ratinhos são infectados com as bactérias recombinantes que expressam uma luciferase, tal como o operão lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bactérias, em seguida, pode ser detectado através da sua produção de luz, utilizando um CCD com base no sistema de imagem in vivo 3,6,9. É importante ressaltar que apenas micro-organismos metabolicamente ativas são bioluminescentes (BL), ou seja, somente as células bacterianas viáveis são detectados por esta metodologia 10,11. Usando 2D BLI, o local da fonte de BL é inferida a partir da superfície do animal, onde o sinal é emitido 8. A localização anatómica exacta dos focos BL in vivo tem de ser determinada através da análise ex vivo de órgãos 3,6,9 Em contraste, a luz difusa 3D tomografia composto (DLIT) pode ser usado para compilar uma reconstrução 3D quantitativa do BL fonte 12. DLIT é realizada através da recolha de imagens BL tiradas com filtros ópticos passa-banda estreitos e definidosposteriormente, introduzindo-os em uma tomografia óptica reconstrução 3D algoritmo difuso 1,7,12,13.
Actualmente, imagiologia multimodalidade é o único método disponível para se verdadeira localização anatómica não-invasivo de focos bioluminescente in vivo, sem a necessidade de análise ex vivo. Recentemente, foi utilizada uma combinação de DLIT co-registradas com μCT de imagem para avaliar Citrobacter rodentium (C. rodentium) dinâmica de colonização após o tratamento profilático com uma bactéria probiótica 7. C. rodentium é um patógeno entérico específico murino usado para infecção humana com modelo enteropatogênico e enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infecção rodentium provoca colite, normalmente associada com perda moderada de peso, diarréia, polarizada Th1 de resposta imune e alterações patológicas distintas, incluindo hiperplasia da cripta do cólon e anexando e discreto lesão formatiem 14. Além disso, C. patogênese rodentium tem sido exaustivamente estudada usando BLI e sua dinâmica de colonização em camundongos C57BL/6J estão bem documentados, fazendo com que esta bactéria um microorganismo modelo ideal para uso com multi-modalidade de imagem 3,4,7.
Este protocolo é o primeiro a descrever uma metodologia para imagiologia DLIT-μCT integrada de uma infecção bacteriana utilizando uma única plataforma multimodalidade imagiologia, o IVIS Espectro de CT, e a geração de um filme 4D mostra os verdadeiros dinâmica desta infecção não-invasiva.
O filme 4D de infecção bacteriana fornece uma ferramenta útil para visualizar e interpretar grandes quantidades de dados de imagem multi-modalidade com rapidez e facilidade. Esta técnica facilita a análise pormenorizada de como uma infecção se espalha por meio de um rato individual e pode ser utilizado para investigar a forma como a eliminação de hospedeiro ou de genes bacterianos ou estratégias de intervenção particular, efeito da carga bacteriana, distribuição e localização durante um estudo longitudinal 7. Estes vídeos também fornecem materiais didáticos úteis e um meio de divulgação de informações ao público.
Existem vários passos críticos neste protocolo que poderiam afectar a qualidade dos dados obtidos a partir de DLIT-μCT imagem e a capacidade para elaborar um vídeo 4D da infecção. A parte mais importante deste protocolo é a infecção bem sucedida e homogênea de ratos com C. rodentium. É essencial que os ratinhos usados para o estudo são entre 18-20 g e que o bactericidariais inóculos são preparados e cerca de 5 x 10 9 ufc, como descrito anteriormente 2,3. Antes da infecção dos ratos, é importante verificar que o inoculo é bioluminescente utilizando o Espectro de CT e uma vez que o inóculo foi preparado, tem de ser continuamente homogeneizada antes de cada rato é gavaged para assegurar que os ratos recebem doses infecciosas semelhantes. A imagem DLIT-μCT de camundongos foi otimizado para que a função de exposição automática no software 4.3.1 imagem viva determina automaticamente os parâmetros de imagem otimizado para o sinal de estar bem acima do ruído. No entanto, a função de auto-exposição depende de configurações definidas pelo utilizador e os parâmetros que devem ser modificados tal como descrito no procedimento. Não fazer isso irá resultar em imagens de baixa com um baixo número de fótons coletados que não resultar em uma progressão evidente na infecção, como as configurações de fábrica do Spectrum CT para auto-exposição estão programados para os tumores de imagem expressandofirefly luciferase. Reconstruções realizadas utilizando 560-620 nm dar o melhor acordo entre os dados medidos e simulados e, portanto, são os dados mais confiáveis para incluir na reconstrução.
Uma limitação para a utilização de DLIT-μCT é que a radiação ionizante a partir da analise μCT provoca danos de radiação sub-letais, que é cumulativa ao longo de um estudo longitudinal 18. Exposição de radiação sub-letal pode enfraquecer a resposta imune, causar danos no ADN e apoptose em órgãos internos 19. Em última análise, os danos da radiação sub-letal cumulativo pode causar a morte, se o LD 50/30 para a radiação ionizante é ultrapassado, o que se situa entre 5 e 7 Gy, dependendo da estirpe de ratinho e da idade dos ratos utilizados 18,20,21. Embora alguns dos danos molecular das radiações ionizantes podem curar, desde o princípio primordial é estimar a dose de forma conservadora, este não é normalmente contabilizados no planejamento do estudo. Em vez disso, o objetivo é ficar o mais below esses limites quanto possível, enquanto ainda realizar os objetivos do estudo. Isto é particularmente importante no presente estudo, devido à resposta imunitária normal à infecção, a frequência de imagem, e o facto transgénicas, imuno-formado, ou fortemente os animais infectados podem ser mais sensíveis à radiação ionizante.
Ao planear a experiência para gerar um filme 4D da infecção, é importante ter em conta a duração da experiência, o número de μCT verifica necessário durante este período e o LD 50/30 para a radiação ionizante para a estirpe de ratinho a ser utilizado. Outra limitação potencial ao DLIT-μCT é a força de expressão do repórter no interior da estirpe bacteriana a ser utilizada, pois isso irá afectar os limites de detecção de bactérias e tempos de imagem. É altamente recomendável que os pesquisadores usam validado cepas bacterianas que são totalmente virulenta, mas otimizado para máxima lux operon expressão, como demonstrado anteriormente para BLI2,3.
Uma ressalva ao projeto atual da imagem 4D é que cada filme é composto de exames individuais DLIT-μCT que têm diferente escala fóton. Isto pode tornar as imagens difíceis de interpretar se as alterações para a localização de focos BL, ou a sua intensidade ser subtil, ou se houver uma atenção intensa BL rodeado por focos fraco múltipla. Portanto, para a visualização longitudinais, é importante para manter as barras de cor consistentes entre os pontos de tempo.
O conceito de um filme 4D da infecção pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano adequadamente rotulado. Desenvolvimento futuro desta técnica terá como objetivo usar a fluorescência tomografia (FLIT), bem como DLIT para facilitar a investigação da resposta do hospedeiro à infecção usando uma combinação de patógenos bacterianos bioluminescentes e injetáveis fluorescentes perto sondas infravermelhas para investigar respostas do hospedeiro à infecção. Em adição a isso, neste protocolo, sódescrevem a utilização de bactérias bioluminescentes para criar 4D filmes de infecção. No entanto, em alguns casos, pode ser necessário o uso de bactérias marcadas fluorescentes, por exemplo marcados com IRFP, de modo que o repórter bioluminescente pode ser utilizado para a investigação genética hospedeiro durante a infecção. Mais importante, o uso de imagens multi-modalidade combinando DLIT / FLIT-μCT permitirá investigar de forma não invasiva vários parâmetros durante uma infecção bacteriana, o que vai contribuir significativamente para a redução, refinamento e substituição do uso de animais em pesquisa científica conforme descrito na iniciativa da NC3R ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
A facilidade de imagem in vivo no Imperial College foi financiado pelo MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |