Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.
Glikosifingolipidler (GSL) 'ın böyle bir embriyonik gelişim, sinyal iletimi ve immün reseptör tanıma 1-2 gibi önemli biyolojik süreçler için yapısal bilgiler ayı biomacromolecules, en glycoconjugate sınıfına aittir. Bu kompleks izomerler şeklinde şeker parçalan, ve yağ asil zincir uzunluğu, doymamışlık ve hidroksilasyon ile varyasyonları dahil olmak üzere, lipid parçalarını içerir. Karbonhidrat ve seramid bölümleri Hem biyolojik önemi temeli olabilir. Örneğin, üç-hexosylceramides globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) ve aynı moleküler kitleleri, ancak 3-4 tamamen farklı biyolojik işlevleri için sorumlu karbonhidrat kısmın, belirgin şeker bağların sahip isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) da içermektedir. Başka bir örnek olarak, gösterilmiştir ki alfa-galactosylceramide, invari için güçlü bir agonist ligandının seramid kısmının modifikasyonukarınca NKT hücreleri, kanser ve oto-immün hastalıklar 5 hayvan modellerinde değişiklikler, sitokin salgılama profilleri ile işlev. Bağışıklık organlarda izomerleri ve hücrelerin yapısal bir analizini yapmakta zorluk çok biyolojik fonksiyonları 6 belirlemek için bir bariyer görevi görür.
Burada, 7-9 bağışıklık hücreleri içinde glycosphingolipid profillerin, nispeten basit, hızlı ve hassas analiz için bir yöntem, bir biçim ortaya görüntülenmiştir. Bu yöntem, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon kullanan sonraki analizi ile Glikosifingolipidler 10-15 çıkarılması ve kimyasal modifikasyonu (permethylation, Şekil 5A aşağıya bakınız, heksoz bölgesinin tüm OH gruplarının permethylation sonra reaksiyon MeO ile değiştirildi), zamana dayalı -uçuş kütle spektrometresi (MALDI-TOF/MS) ve iyon tuzağı kütle spektrometresi. Bu yöntem, bir tam bir analiz için 50 milyon bağışıklık hücrelerini gerektirir. Deneyler bir hafta içinde tamamlanabilir. Çeşitli Glikosifingolipidler nispi bolluk sentetik standartlar ile karşılaştırma ile tarif edilebilir. Toplam iGb3/Gb3 karışım 2 fmol 9 mevcut olduğunda, bu yöntem, GB 3 izomerler arasında% 1 iGb3 ölçmek için bir hassasiyete sahiptir.
Iyon tuzak kütle spektrometrisi izomerleri analiz etmek için de kullanılabilir. Örneğin, aynı numune içinde globotriaosylceramide ve isoglobtriaosylceramide varlığını incelemek için, bir yapısal iki (Şekil 5 aşağıya bakınız) arasında ayrım glycosphingolipid moleküllerin parçalanma kullanılabilir. Ayrıca, şeker parçalan kimyasal modifikasyonu (a permethylation reaksiyon ile) daha yüksek duyarlılık ve spesifite için iyonizasyon ve parçalanma verimi artırır ve siyalik asit kalıntılarının kararlılık artar. Glikosifingolipidler çıkarma ve kimyasal modifikasyonu, klasik bir edilebilir başlık kimyasal olarak yapılabilir, ve kütle spektrometrisi çekirdek ile gerçekleştirilebiliriyon tuzağı MS enstrümanları ile tesisleri.
Glycome, genom ve proteom benzerlik içindeki bir terim, bir organizmanın tüm sakarit yapılarını ifade eder. Tam glikozilasyon manifoldu fonksiyonlarını kavramak hem işlevsel hem de yapısal glycomics çalışmaları da dahil olmak üzere entegre bir yaklaşım gerektirir. Hem glukanıdır biyosentezi, glukanıdır yapıların oluşabilecek karmaşıklığı ve çeşitliliği, moleküler düzeyde modülasyonlu glukanıdır ligand-reseptör etkileşimlerinde aglikon yapısının sık tutulum, ve düşük bolluk ligandların fonksiyonel önemi olmayan şablon odaklı doğa tarafından karmaşıktır.
Bu, genel olarak kütle spektrometrisi (MS), özellikle düşük bolluk ligandlar tanımlanması ve karakterize edilmesi için yapısal glycomics çalışmalar için vazgeçilmez bir yöntem olduğu genel olarak kabul edilmektedir. Moleküler türler olarak glukanlardır veya glycoconjugates gözlemlemek için genellikle elektrosprey iyonizasyon (ESI) adlı yüksek verimli, düşük enerji iyonizasyon yöntemi kullanın. Daha det içinglukanıdır yapısının karakterizasyonu ailed, bireysel moleküler türler seçmek ve küçük parçalar halinde glukanlardır kırmak için esastır. Bu, normal olarak atıl gaz molekülleri ile çarpışma sayesinde glukanlardır aktive içerir çarpışma ile endüklenen ayrışma ile yapılır. Daha fazla enerji ile bağ kırılmasının indükler, ve sonuçta elde edilen parça, sistematik analiz glikan moleküler yapısı hakkında bilgi sağlar. Genellikle, "imza" parçaları özellikle glukanıdır yapısal özellikler için tanısal olduğu oluşturulabilir. Birlikte moleküler kütle ile, aşağıdaki yapı parçaları yeni olup, özellikle de bazen glukanlardır tanımlamak için yeterli olabilir, ancak son olarak çok daha fazla bilgi tam olarak karakterize etmek için gerekli olmuştur. Bu yöntemler, şeker bileşim analizi, bağlantı analizi için kısmen metillenmiş alditol asetat arasında gaz kromatografi analizi kütle spektrometrisi, ve spesifik glycosidase sindirim 17 içerir.
<p class="Jove_content"> As son on yıl boyunca 18-19 gösterildiği gibi, etkili bir şekilde (IT-MS), bir iyon tuzak kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir düşük enerji parçalanma, birden fazla yuvarlak, çok glikan kütle spektral analizi ile bilgi verimi artırır . Parçalanma (diğer MS araçları ile yapılabilir edilemeyen) dört ya da beş tur ile, bu aynı olan bileşenleri karışımı içinde bir arada mevcut olsa bile, farklı bir şeker bağlar düzenlenmiş aynı şeker bileşenleri içeren izomerik glukanlardır ayırt etmek mümkündür molekül kütlesi (İzobarları). Bu analiz için, glukanlardır permethylation kullanılarak metil grupları ile tüm serbest hidroksil gruplarının yerine, türevlendirilmiş edildi. Glukanlardır yapısal atama permethylation olmadan mümkün olsa da, permethylation duyarlılık 17 artar.Levery ve Zhou, izomerik stru tespiti de dahil olmak üzere BT-MS yöntemi potansiyel tüm avantajlarını, birleştirdikBirden çok izobarik karışımları 7-9 şeklinde mevcut Glikosifingolipidler son derece hassas kimlik ve miktarının belirlenmesi için MS 4 ve 5 MS spektrumları olarak gözlenebilir imza teşhis iyonları kullanılarak ctures. Teoride, biz kimyasal sentez edilebilir standart glikolipidlerin durumu bekleyen, mevcut her glikolipid yapısını tespit etmek mümkün olabilir.
Bu analizin kritik adımlar biyolojik örneklerden GSLs iyileşme oranı vardır. GSL Tipik olarak 80 ug örneğin RBL olarak 100 milyon tümör hücrelerinden elde edilebilir. Iyon tuzağı Massenspektrometer parçalanma çok sayıda mermi için yeterli molekül iyonları üretmek için, tümör GSLs en az 10 mikrogram gereklidir. Saflaştırma sırasında GSLs Düşük verim daha da parçalanma tabi olamazdı iyonlar, düşük bolluk yol açacaktır. Analiz başarı elde edilmiştir GSLs miktarına bağlıdır. Tipik olarak, son konspermethylated GSLs ve entration bir nano-elektrosprey kaynak üzerinde analiz edilmeden önce, metanol içinde çözülmüş 1 mg / ml, ulaşması gerekir. Ayrıntılı bir MS n analizi için sınır MS 1 profilindeki spesifik iyon bolluğu bağlıdır. Tipik bir e 7 iyon bolluğu tam bir MS 5 analizi için gereklidir. Saflaştırma sırasında GSLs ve düşük verim başına asetillenmiş GSLs, Florisil reçine kromatografi kolonuna bağlı yıkanmış, ve daha sonra akıtılan olmalıdır peracetylation aşaması esnasında GSLs kaybı (fosfolipid kaldırılır) neden olabilir. Silis jel ile per-asetillenmiş GSLs bir bağlayıcı sağlamak için, numune içinden akan sonra sütun kromatografi ile iki kere yeniden olmalıdır.
The authors have nothing to disclose.
DZ MD Anderson Kanser Merkezi ve NIH hibe AI079232 tarafından desteklenmektedir. MD Anderson Kanser Merkezi NIH hibe CA16672 tarafından kısmen desteklenmektedir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |