Eine spezifische und sensitive Methode, um Einblick in die Expression von Glykosphingolipid Antigene Immunsystem Organe und Zellen zu gewinnen beschrieben. Das Verfahren nutzt die Ionenfallenmassenspektrometer ermöglicht stufenweise Fragmentierung Glycosphingolipid Moleküle zur Strukturanalyse gegenüber chemisch synthetisierten Standard.
Glykosphingolipide (GSL die) gehören zur Klasse der Biomakromoleküle Glycokonjugat, das strukturelle Informationen für signifikante biologische Prozesse wie bei der Embryonalentwicklung, Signaltransduktion, und Immun Rezeptorerkennung 1-2 ertragen. Sie enthalten komplexe Zuckerreste in Form von Isomeren, und Lipidgruppierungen mit Variationen einschließlich Fettacyl Kettenlänge, Ungesättigtheit und Hydroxylierung. Beide Kohlenhydrat-und Ceramid Abschnitte können aufgrund der biologischen Bedeutung sein. Zum Beispiel schließen Tri-hexosylceramides Globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) und isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), die gleich, aber unterschiedliche Molmassen Zucker-Verknüpfungen der Kohlenhydratanteil, verantwortlich für völlig unterschiedliche biologische Funktionen haben 3-4. In einem anderen Beispiel wurde gezeigt, dass eine Modifikation des Ceramid Teil alpha-Galactosylceramid, ein potenter Ligand-Agonist für Invariantenant NKT-Zellen, Änderungen ihrer Zytokinsekretion Profilen und Funktion in Tiermodellen von Krebs und Autoimmunerkrankungen 5. Die Schwierigkeit bei der Durchführung einer Strukturanalyse von Isomeren in Immun Organen und Zellen dienen als Barriere zur Bestimmung viele biologische Funktionen 6.
Hier präsentieren wir eine visualisierte Version einer Methode für relativ einfache, schnelle und sensitive Analyse von Glykosphingolipid Profile in Immunzellen 7-9. Dieses Verfahren basiert auf Extraktion und chemischen Modifikation (Permethylierung, siehe unten 5A, alle OH-Gruppen der Hexose wurden durch MeO nach Permethylierung Reaktion ersetzt) von Glycosphingolipiden 10-15, durch anschließende Analyse mittels Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-Basis verfolgt of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) und Ionenfallenmassenspektrometer. Diese Methode erfordert 50 Millionen Immunzellen für eine vollständige Analyse. Die Experimente können innerhalb einer Woche abgeschlossen sein. Die relative Häufigkeit der verschiedenen Glycosphingolipiden kann durch Vergleich mit synthetischen Standards abgegrenzt werden. Diese Methode hat eine Empfindlichkeit der Messung 1% iGb3 unter Gb3 Isomere, wenn 2 fmol des gesamten iGb3/Gb3 Gemisch vorhanden ist 9.
Ionenfallenmassenspektrometer Isomeren kann verwendet werden, um zu analysieren. Zum Beispiel, um das Vorhandensein von Globotriaosylceramid und isoglobtriaosylceramide in der gleichen Probe zu analysieren, kann man die Fragmentierung der Glykosphingolipid Moleküle strukturell zwischen den beiden (siehe unten Abbildung 5) zu unterscheiden. Weiterhin verbessert die chemische Modifikation der Zuckergruppierungen (durch eine Permethylierung Reaktion) die Ionisierung und Fragmentierung Wirkungsgrade für höhere Empfindlichkeit und Spezifität, und erhöht die Stabilität der Sialinsäurereste. Die Extraktion und chemische Modifikation von Glykosphingolipiden kann in einem klassischen chemischen zertifizierten Abzug durchgeführt werden, und das kann durch Massenspektrometrie Kern durchgeführt werdenEinrichtungen mit Ionenfalle MS Instrumente.
Die Glykoms, ein Begriff in Analogie zu dem Genom und Proteom geprägt, bezieht sich auf alle Saccharid-Strukturen eines Organismus. Um vollständig zu verstehen, die vielfältigen Funktionen der Glykosylierung ist ein integrierter Ansatz, der sowohl funktionelle und strukturelle Glykomik Studien. Beide werden von der nicht-angetriebenen Schablone Art Glycan-Biosynthese, die resultierende Komplexität und Vielfalt der Glycanstrukturen, die häufige Beteiligung Aglykon Struktur in Modulieren Glycan Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf molekularer Ebene, und die funktionelle Bedeutung von geringer Häufigkeit Liganden kompliziert.
Es ist allgemein anerkannt, dass Massenspektrometrie (MS) ein unverzichtbares Verfahren zur strukturellen Glykomik Studien, insbesondere zur Identifizierung und Charakterisierung niedriger Häufigkeit Liganden ist. Um Glycane oder Glycokonjugate als molekulare Spezies beobachten, wir verwenden häufig eine hocheffiziente, niedrige Energie Ionisation Methode, genannt Elektrospray-Ionisation (ESI). Für weitere detfehlte Charakterisierung Glykanstruktur, ist es wichtig, einzelne molekulare Spezies auszuwählen und brechen die Glykane in kleinere Stücke. Dies wird normalerweise durch Kollision-induzierte Dissoziation, die Aktivierung der Glycane durch Kollision mit inerten Gasmolekülen beinhaltet getan. Die erhöhte Energie induziert Bindungsbruch und systematische Analyse der resultierenden Fragmente liefert Informationen über die molekulare Struktur des Glycan. Oft können "Signatur"-Fragmente erzeugt werden, die für bestimmte Glykan strukturelle Merkmale diagnostischen werden. Zusammen mit der Molekularmasse können diese Fragmente manchmal ausreichend zum Identifizieren Glycane, aber in der Vergangenheit viel mehr Informationen verlangt worden, um sie vollständig zu charakterisieren, besonders wenn die Struktur neu ist. Diese Verfahren umfassen Zuckerzusammensetzung Analyse, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse von teilweise methylierten Alditolacetate für Kopplungsanalyse und spezifischen Glykosidase Verdauung 17.
<p class="Jove_content"> Wie im vergangenen Jahrzehnt 18-19 gezeigt, mehrere Runden von Niedrigenergiehäusern Fragmentierung, die effektiv durchgeführt werden kann in einem Ionenfallen-Massenspektrometer (IT-MS), verbessert die Informationen Ausbeute von Glykan massenspektrometrische Analyse . Mit vier oder fünf Runden der Fragmentierung (das kann nicht mit anderen MS-Geräten durchgeführt werden), ist es möglich, isomeren Glykane, die die gleichen Zucker-Komponenten in verschiedenen Zucker-Verknüpfungen angeordnet enthalten unterscheiden, selbst wenn diese vorhanden sind zusammen in Mischungen von Komponenten mit der gleichen Molmasse (Isobaren). Für diese Analyse wurden die Glykane derivatisiert, ersetzt alle freien Hydroxylgruppen mit Methylgruppen mit Permethylierung. Während strukturelle Zuordnung der Glykane ohne Permethylierung möglich, erhöht sich die Permethylierung Empfindlichkeit 17.Levery und Zhou, haben alle potenziellen Vorteile von IT-MS Methodik, einschließlich der Ermittlung der isomeren stru kombiniertctures Verwendung Signatur diagnostische Ionen, 4 nur im MS und MS-Spektren 5 beobachtbar ist, zum hochempfindlichen Identifizierung und Quantifizierung von Glycosphingolipiden in Form mehrerer isobaren Mischungen 7-9. In der Theorie können wir in der Lage sein, jeden bestehenden Glykolipid Struktur zu identifizieren, bis die Verfügbarkeit von Standard-Glykolipide, die chemisch synthetisiert werden können.
Die kritischen Schritte dieser Analyse sind die Recovery Rate von GSL aus biologischen Proben. Typischerweise 80 ug GSL kann von 100 Millionen Tumorzellen wie RBL zurückgewonnen werden. Um eine ausreichende molekulare Ionen für mehrere Runden der Fragmentierung in Ionenfallen-Massenspektrometer zu erzeugen, werden mindestens 10 Mikrogramm des Tumors GSLs erforderlich. Geringe Ausbeute von GSL während der Reinigung wird auf niedriger Häufigkeit von Ionen, die nicht zu einer weiteren Fragmentierung unterworfen werden könnten. Der Erfolg der Analyse ist abhängig von der Menge von GSL welche wiedergewonnen werden. Typischerweise Endkonz.entration der permethylierten GSLs erreichen sollte 1 mg / ml, in Methanol gelöst, bevor sie auf einem Nano-Elektrospray-Quelle analysiert. Der Grenzwert für eine gründliche Analyse MS n ist abhängig von der Häufigkeit des spezifischen Ions in MS 1 Profil. Eine typische e 7 Ionenhäufigkeit ist für eine gründliche MS 5 Analyse erforderlich. Die geringe Ausbeute von GSL während der Reinigung kann durch den Verlust von GSL während Peracetylierung Schritt (die entfernt die Phospholipide), wenn die pro-acetylierten GSLs um Florisil Harz Chromatographiesäule muss gebunden werden, gewaschen und anschließend eluiert verursacht werden. Um die Bindung von Pro-acetylierten GSLs an Silicagel zu gewährleisten, sollten die Proben zweimal in die Chromatographiesäule geladen werden nach Durchströmen.
The authors have nothing to disclose.
DZ wird von MD Anderson Cancer Center und NIH Zuschüsse AI079232 unterstützt. MD Anderson Cancer Center wird zum Teil durch NIH CA16672 unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |