Une méthode spécifique et sensible pour mieux comprendre le profil d'expression des antigènes de glycosphingolipides dans les organes et les cellules immunitaires est décrite. La méthode tire parti de la spectrométrie de masse à piège ionique permettant progressive fragmentation de molécules de glycosphingolipides pour l'analyse structurelle par rapport aux normes synthétisés chimiquement.
Glycosphingolipides (GSL) appartiennent à la classe glycoconjugué de macromolécules biologiques, qui portent des informations structurales importantes pour les processus biologiques comme le développement embryonnaire, la transduction du signal, et la reconnaissance du récepteur immunitaire 1-2. Ils contiennent des groupements sucres complexes sous la forme d'isomères, et des fractions lipidiques à des variations dont la longueur d'acyle gras à chaîne, une insaturation, et l'hydroxylation. Les deux parties d'hydrate de carbone et de céramide peut être à la base de la signification biologique. Par exemple, les tri-hexosylceramides comprennent globotriaosylcéramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) et isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), qui ont des masses moléculaires identiques mais distincts de liaisons sucre résidu hydrate de carbone, complètement chargé de différentes fonctions biologiques 3-4. Dans un autre exemple, il a été démontré que la modification de la partie céramide de l'alpha-galactosylcéramide, un ligand agoniste puissant pour invaant les cellules NKT, les changements de leur profil de sécrétion de cytokines et de fonctions dans des modèles animaux de cancer et de maladies auto-immunes 5. La difficulté à effectuer une analyse structurale des isomères dans les organes immunitaires et les cellules servent de barrière pour la détermination de nombreuses fonctions biologiques 6.
Ici, nous présentons une version visualisée d'une méthode d'analyse relativement simple, rapide et sensible des profils de glycosphingolipides dans les cellules immunitaires 7-9. Cette méthode est basée sur la modification de l'extraction et chimiques (perméthylation, voir ci-dessous la figure 5A, tous les groupes OH des hexoses ont été remplacés par MeO après réaction perméthylation) de glycosphingolipides 10-15, suivie d'une analyse ultérieure en utilisant laser assistée par matrice de désorption / ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS) et la spectrométrie de masse à ions piège. Cette méthode nécessite 50 millions de cellules immunitaires pour une analyse complète. Les expériences peuvent être complétés d'ici une semaine. L'abondance relative des différents glycosphingolipides peut être délimitée par rapport aux normes de synthèse. Cette méthode a une sensibilité de mesure de 1% parmi les iGb3 Gb3 isomères, lorsque 2 fmol du total iGb3/Gb3 mélange est présent 9.
Spectrométrie de masse des ions piège peut être utilisé pour analyser les isomères. Par exemple, pour analyser la présence de globotriaosylcéramide et isoglobtriaosylceramide dans le même échantillon, on peut utiliser la fragmentation de molécules structurellement glycosphingolipides à discriminer entre les deux (voir ci-dessous figure 5). En outre, la modification chimique des fractions de sucre (par le biais d'une réaction perméthylation) améliore l'efficacité d'ionisation et de fragmentation pour une meilleure sensibilité et spécificité, et augmente la stabilité des résidus d'acide sialique. La modification chimique d'extraction et de glycosphingolipides peut être réalisée dans une hotte certifiée chimique classique, et la spectrométrie de masse peut être effectué par le noyauinstallations avec des instruments d'ions MS piège.
Le glycome, un terme inventé par analogie avec le génome et du protéome, se réfère à toutes les structures saccharidiques d'un organisme. Pour bien comprendre les multiples fonctions de glycosylation exigera une approche intégrée incluant deux études fonctionnelles et structurales glycomique. Les deux sont compliquées par la nature non-template axé sur la biosynthèse des glycanes, la complexité qui en résulte et la diversité des structures des glycanes, la participation fréquente de la structure aglycone dans la modulation des glycanes interactions ligand-récepteur au niveau moléculaire, et l'importance fonctionnelle de ligands de faible abondance.
Il est généralement admis que la spectrométrie de masse (MS) est une méthode indispensable pour les études en glycomique structurelles, en particulier pour l'identification et la caractérisation des ligands de faible abondance. Pour observer glycanes ou glycoconjugués que les espèces moléculaires, on utilise souvent un très efficace, la méthode d'ionisation faible énergie, appelée ionisation par électrospray (ESI). Pour plus d'detailed caractérisation de la structure glycane, il est essentiel de choisir des espèces moléculaires individuelles et de briser les glycanes en petits morceaux. Cela se fait normalement par dissociation induite par collision, ce qui implique l'activation des glycanes par collision avec les molécules de gaz inertes. L'énergie a augmenté induit rupture de liaison, et l'analyse systématique des fragments résultants fournit des informations sur la structure moléculaire du glycane. Souvent, "signature" fragments peuvent être générés qui sont de diagnostic pour certains glycanes caractéristiques structurelles. En collaboration avec la masse moléculaire, ces fragments peuvent parfois suffire pour identifier les glycanes, mais dans le passé beaucoup plus d'informations a été nécessaire de bien les caractériser, en particulier si la structure est nouvelle. Ces méthodes comprennent l'analyse la composition en sucre, chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse partiellement méthylés acétates d'alditol pour l'analyse de liaison, et la digestion glycosidase spécifique 17.
<p class="Jove_content"> Comme l'a démontré au cours de la dernière décennie 18-19, plusieurs tours de la fragmentation de faible énergie, qui peut être efficacement réalisé dans un spectromètre de masse à trappe d'ions (IT-MS), améliore considérablement le rendement de l'analyse des informations glycane spectrométrie de masse . Avec quatre ou cinq tours de fragmentation (qui ne peut être fait avec des instruments d'autres EM), il est possible de distinguer glycanes isomères qui contiennent les composants de sucre mêmes disposées dans des liaisons sucre différents, même lorsque ceux-ci sont présents ensemble dans des mélanges de composants avec le même masse moléculaire (isobares). Pour cette analyse, les glycanes ont été dérivés, en remplacement de tous les groupes hydroxyles libres avec des groupes méthyliques à l'aide perméthylation. Alors que l'affectation de la structure des glycanes est possible sans perméthylation, le perméthylation augmente la sensibilité à 17.Levery et Zhou, ont combiné tous les avantages potentiels de la TI-MS méthodologie, y compris la détection des isomères strumages utilisant des ions signature de diagnostic, observables seulement dans MS 4 et MS 5 spectres, pour l'identification et la quantification très sensible de glycosphingolipides présents sous forme de mélanges de plusieurs isobares 7-9. En théorie, nous pourrions être en mesure d'identifier chaque structure existante glycolipide, dans l'attente de la disponibilité des glycolipides standard, qui peuvent être synthétisés chimiquement.
Les étapes essentielles de cette analyse sont les taux de récupération de GSL à partir d'échantillons biologiques. Typiquement 80 pg de GSL peuvent être récupérés à partir de 100 millions de cellules tumorales comme RBL. Pour générer suffisamment d'ions moléculaires pour de multiples séries de fragmentation dans les spectromètres de masse d'ions piège, au moins 10 microgrammes de GSL tumorales sont nécessaires. Faible rendement de GSL cours de la purification mènera à la faible abondance des ions, qui ne pouvaient pas être soumis à une nouvelle fragmentation. La réussite de l'analyse est fonction de la quantité de GSL qui sont récupérés. En règle générale, concentration finaleentration de GSL perméthylés devrait atteindre 1 mg / ml en solution dans le méthanol, avant d'être analysés sur une source de nano-électrospray. La limite pour une analyse approfondie MS n dépend de l'abondance de l'ion spécifique dans MS 1 profil. Une abondance d'ions e typique 7 est requis pour un examen approfondi MS 5 analyse. Le faible rendement des GSL cours de la purification peut être causée par la perte de GSL lors de l'étape peracétylation (qui supprime les phospholipides), lorsque les GSL par acétylés doit être liée à la colonne Florisil chromatographie sur résine, lavées et ensuite éluée. Afin d'assurer la liaison de per-acétylés GSL de gel de silice, les échantillons doivent être rechargé deux fois pour la colonne de chromatographie après avoir traversé.
The authors have nothing to disclose.
DZ est pris en charge par MD Anderson Cancer Center et des subventions du NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center est soutenu en partie par le NIH subvention CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |