一个特异和敏感的方法来深入了解糖脂抗原的免疫器官和细胞的表达谱。该方法利用离子阱质谱可以逐步碎裂的糖脂分子结构分析,比较,化学合成的标准。
鞘糖脂(GSL)属于生物大分子的糖缀合物类,其中承担重要的生物过程,如胚胎发育,信号转导,免疫受体识别1-2的结构信息。它们包含复杂的糖部分中的异构体形式,和脂质部分的变化,包括脂肪酰基链长,不饱和度,和羟化。碳水化合物和神经酰胺部分可能是生物学意义的基础。例如中,三正hexosylceramides包括globotriaosylceramide(Galα4Galβ4Glcβ1Cer)和isoglobotriaosylceramide(Galα3Galβ4Glcβ1Cer),它们具有相同的分子量,但不同的糖联系的碳水化合物部分,负责为完全不同的生物功能3-4。在另一个例子中,它已被证明,变形例的神经酰胺部分的α-半乳糖神经酰胺,不变性一种有效的激动剂配体的蚂蚁NKT细胞,改变细胞因子的分泌分布和功能的动物模型的癌症和自身免疫疾病5。异构体的免疫器官和细胞中的困难进行了结构分析作为确定多种生物学功能的障碍。
在这里,我们提出了一个可视化的版本的方法比较简单,快速,灵敏的分析免疫细胞糖脂配置文件中7-9。这种方法是基于对提取和化学改性(permethylation,请参见下面的图5A,所有的OH基的己糖被替换后的MeO反应permethylation)的鞘糖脂10-15,然后通过随后的分析,使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 – 飞行质谱(MALDI-TOF/MS)和离子阱质谱的。这种方法需要50万的免疫细胞为一个完整的分析。在一个星期内就可以完成的实验。可以划定的相对丰度的各种糖脂合成标准进行比较。此方法具有的灵敏度的测量之间GB3异构体的1%iGb3,当2总iGb3/Gb3混合物的fmol的是本9。
可以使用离子阱质谱法分析的异构体。例如,分析globotriaosylceramide和isoglobtriaosylceramide的存在下,在同一样品中,一个可以使用的碎片鞘糖脂分 子在结构上区分的两个(见下面的图5)。此外,化学改性的糖部分(通过permethylation反应)提高更高的灵敏度和特异性的电离和分散的效率,并且增加的唾液酸残基的稳定性。可以执行在一个典型的认证化学罩的提取和化学修饰的鞘糖脂,并且可以由核心进行质谱离子阱MS仪器与设施。
糖组,相似的基因组和蛋白质组提出的一个术语,指的是所有的糖结构的有机体。要完全领会多方面的功能的糖基化将需要一个综合的方法,包括功能和结构的糖组学研究。两者是复杂的由非模板驱动的性质聚糖的生物合成,得到的聚糖结构的复杂性和多样性,糖苷配基的结构的调制糖链在分子水平上的配体 – 受体相互作用的频繁参与,和低丰度配位体的功能的重要性。
人们普遍接受,质谱(MS)是一种不可缺少的结构糖组学的研究,特别是用于识别和表征低丰度配位体的方法。观察聚糖或糖复合物的分子种类,我们经常使用的一种高效,低能量的离子化方法,称为电喷雾电离(ESI)。欲了解更多DETailed聚糖结构表征,它是必不可少的选择个别分子物种和打破聚糖成更小的碎片。这通常是通过碰撞诱导解离,其中涉及通过与惰性气体分子碰撞激活聚糖。增加能量导致键断裂,产生的碎片系统的分析提供信息的糖链分子结构。通常情况下,特别是糖链的结构特点,诊断为“签名”的片段,可以产生。这些片段与分子质量一起,有时可以是足够用于识别聚糖,但在过去已被要求更多的信息完全表征它们,尤其是如果该结构是新颖的。这些方法包括糖组成分析,气相色谱-质谱分析用于连锁分析的部分甲基化的醛醇乙酸酯,和特定的糖苷酶消化17。
<p class=的“jove_content”>表明在过去的十年18日至19日 ,多轮的低能量碎片,这可以有效地进行离子阱质谱仪(IT-MS),大大提高了信息的产量聚糖质谱分析。四个或五个轮碎片(这可以没有被完成与其他MS文书),可以区分的异构体聚糖包含的相同的糖组件布置在不同的糖的联系,即使当这些是本一起的组件的混合物中具有相同的相对分子质量(等压线)。对于这种分析,聚糖衍生,免费更换所有的羟基甲基使用permethylation的。虽然聚糖的结构分配是可能的没有permethylation,的permethylation增加灵敏度17。Levery,周,结合了IT-MS方法的潜在优势,包括结构性的同分异构体的检测ctures使用签名诊断离子,只观察到在MS和MS 5光谱,高度敏感的鉴定和定量的形式的多个同量异序的混合物7-9本鞘糖脂。从理论上讲,我们可以能够识别每一个现有的糖脂结构,以待的可用性标准的糖脂,可以通过化学方法合成的。
的分析结果的关键步骤是GSLS从生物样品中的回收率。通常为80微克GSL可以恢复肿瘤细胞如RBL从100万。以产生足够的分子离子的多个轮中的碎片离子阱质谱仪,至少10微克肿瘤GSLS是必需的。在纯化过程中,会导致低收率GSLS低丰度的离子,不能进行进一步破碎。分析的成功依赖于GSLS回收量。通常情况下,最终浓entration的全甲基GSLS应达到1毫克/毫升,溶解在甲醇中,在被分析之前在纳米电源。作详细的MS n分析的极限是依赖于特定的离子在MS 1档案中的丰度。一个典型的电子离子丰度需要进行彻底的MS 分析 。可以引起的损失GSLS peracetylation步骤期间(除去磷脂),时每-乙酰化GSLS必须被绑定到硅酸镁载体树脂层析柱,洗涤,并随后洗脱GSLS在纯化过程中的低收率。为了确保每个-乙酰化GSLS硅胶的结合,样品应被重新加载两次色谱柱后流经。
The authors have nothing to disclose.
DZ的支持,MD安德森癌症中心和美国国立卫生研究院拨款AI079232。 MD安德森癌症中心是支持部分由美国国立卫生研究院授予CA16672。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |