免疫臓器や細胞内のスフィンゴ糖脂質抗原の発現プロファイルを洞察するための特異的かつ高感度の方法が記載されている。この方法は、化学的に合成された基準と比較して、構造解析のためのスフィンゴ糖脂質分子の段階的な断片化を許可するイオントラップ質量分析法を活用しています。
スフィンゴ糖脂質(GSLの)は、胚発生、シグナル伝達、免疫受容体認識1-2など重要な生物学的プロセスの構造情報を負担生体高分子、複合糖質のクラスに属する。彼らは複雑な異性体の形で糖部分、および脂肪アシル鎖長、不飽和、および水酸化含むバリエーションを持つ脂質部分を含んでいます。炭水化物とセラミド部分の両方は、生物学的意義の基礎となると考えられる。例えば、トライhexosylceramidesは、同一分子量が、3月4日完全に異なる生物学的機能を担う糖鎖部分の異なる糖結合を持つグロボトリアオシルセラミド(Galα4Galβ4Glcβ1Cer)とisoglobotriaosylceramide(Galα3Galβ4Glcβ1Cer)が含まれます。別の例では、α-ガラクトシルセラミドの一部の変更、不変のための強力なアゴニストリガンドが実証されているアリNKT細胞、がんや自己免疫疾患5の動物モデルにおける変化、そのサイトカイン分泌プロファイルと機能を。免疫臓器や細胞での異性体の構造解析を行うには困難が6多くの生物学的機能を決定するためのバリアとして機能します。
ここでは、7月9日免疫細胞におけるスフィンゴ糖脂質プロファイルの比較的簡単、迅速、かつ高感度な分析法の可視化バージョンを提示します。このメソッドは、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化を使用して、その後の分析に続いスフィンゴ糖10-15の抽出と化学修飾(permethylationは、 図5A以下を参照、ヘキソースのすべてのOH基がpermethylation反応後MEOに取って代わられた)に基づいている時間をの飛行質量分析(MALDI-TOF/MS)とイオントラップ質量分析。この方法は、完全な分析のための5000万免疫細胞を必要とします。実験は1週間以内に完了することができます。さまざまなスフィンゴ糖脂質の相対量は、合成標準規格との比較によって線引きすることができます。この方法は、Gb3の異性体、合計iGb3/Gb3混合物が存在している9の2 fmolの間で1パーセントiGb3の測定感度を持っています。
イオントラップ質量分析法は、異性体の分析に使用できます。例えば、同じ試料中グロボトリアオシルセラミドとisoglobtriaosylceramideの存在を分析するために、一つは構造的に2( 図5下記参照)を区別するスフィンゴ糖脂質分子のフラグメンテーションを使用することができます。さらに、糖部分の化学修飾は、(permethylation反応を介して)より高い感度と特異性のためにイオン化し、断片化の効率を向上し、シアル酸残基の安定性を高めます。スフィンゴ糖脂質の抽出や化学修飾は、古典的な認定化学フード内で行うことができ、質量分析法は、コアによって行うことができるイオントラップMS機器と設備を備えています。
グライコーム、ゲノムとプロテオームと同様に作られた言葉は、生物のすべての糖構造を指す。完全にグリコシル化のマニホールドの機能を理解するために、両方の機能と構造グライコミクス研究を含む統合的なアプローチが必要になります。どちらも、糖鎖の生合成、糖鎖構造の結果として生じる複雑さと多様性、分子レベルで調節する糖鎖リガンドとレセプターの相互作用のアグリコン構造の頻繁な関与、および低濃度のリガンドの機能的重要性の非テンプレート駆動型の性質によって複雑化されています。
これは、一般的に質量分析(MS)は、特に低濃度のリガンドを同定および特徴付けるために、構造グライコミクス研究のために必要不可欠な方法であることが認められている。分子種としての糖鎖または糖質を観察するために、私たちはしばしば、エレクトロスプレーイオン化(ESI)と呼ばれる高効率、低エネルギーイオン化法を使用します。もっとDET用グリカン構造のキャラクタリゼーションailed、それは個々の分子種を選択して、より小さな部分に糖鎖を断ち切ることが不可欠である。これは通常、不活性ガス分子と衝突して、糖鎖を活性伴う衝突誘起解離によって行われます。増大したエネルギーは、債券の破損を誘発し、得られた断片の体系的な分析では、糖鎖の分子構造に関する情報を提供します。多くの場合、 "署名"の断片は、特定の糖鎖構造の機能の診断であることを生成することができます。一緒に分子量を有する、これらの断片は、その構造が新規である場合は特に、時には糖鎖を識別するために十分なことができますが、過去に多くの情報を完全にそれらを特徴づけるために必要とされてきた。これらのメソッドは、糖組成分析、連鎖解析のために部分的にメチル化アルジトールアセテートのガスクロマトグラフィー質量分析、および特定のグリコシダーゼ消化17を含む。
<p class="jove_content">として過去十年間18から19を介して実証し、効果的にイオントラップ型質量分析計(IT-MS)の中で実施することができる低エネルギーの断片化のため、複数のラウンドでは、大幅に糖鎖質量スペクトル分析からの情報収率を向上させる。断片化(他のMS機器を使って行うことができない)の4または5ラウンドで、これらは同じで成分の混合物中に一緒に存在している場合でも、異なる糖結合に配置された同一の糖成分が含まれている異性体糖鎖を区別することが可能である分子量(等圧線)。この分析では、糖鎖はpermethylationを使用してメチル基を持つすべての遊離ヒドロキシル基を置き換えて、誘導体化した。糖鎖構造の割り当てがpermethylationなしで可能ですが、permethylationは感度17を増加させます。LeveryとZhouは、異性STRUの検出など、IT-MSの方法論の潜在的な利点のすべてを組み合わせている7月9日 、複数の同重体の混合物の形で存在するスフィンゴ糖脂質の高感度同定および定量のためのMSとMS 4 5スペクトルにおいてのみ観察署名診断イオンを用いctures。理論的には、化学的に合成することができる標準的な糖脂質の可用性保留中、すべての既存の糖脂質構造を識別することができるかもしれません。
この分析の重要なステップは、生体サンプルから糖脂質の回収率である。 GSLの典型的には80μgのは、RBLなど億腫瘍細胞から回収することができる。イオントラップ型質量分析計内の断片化の複数のラウンドのための十分な分子イオンを生成するには、腫瘍GSLの少なくとも10マイクログラムが必要です。精製中脂質の収率が低い、さらに断片化に供することができなかったイオンの低い存在につながる。解析の成功は、回収される脂質の量に依存します。一般的に、最終濃度完全メチル化糖脂質のentrationは、ナノエレクトロスプレーイオン源で分析される前に、メタノールに溶解した1 mg / mlとを、到達する必要があります。徹底したMS n分析の限界は、MS 1プロファイル内の特定のイオンの存在量に依存しています。一般的なe 7イオンの存在量は、徹底したMSの5分析のために必要とされる。精製中脂質の収率が低いは、per-アセチル化糖脂質は、フロリジル樹脂クロマトグラフィーカラムにバインドされて洗浄し、その後に溶出されている必要があり、過アセチル化ステップの間GSLの損失(リン脂質を除去する)が原因で発生することができます。シリカゲルにあたりアセチル化糖脂質の結合を確保するために、試料を流れる後にクロマトグラフィーカラムに二回リロードする必要があります。
The authors have nothing to disclose.
DZはMDアンダーソンがんセンターおよびNIH助成AI079232によってサポートされています。 MDアンダーソンがんセンターは、NIHの助成金CA16672によって部分的にサポートされています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |