Un metodo specifico e sensibile al fine di conoscere il profilo di espressione di antigeni glicosfingolipidi in organi e cellule immunitarie è descritto. Il metodo sfrutta la spettrometria di massa a trappola ionica consentendo graduale frammentazione delle molecole glicosfingolipidi per l'analisi strutturale rispetto agli standard sintetizzati chimicamente.
Glicosfingolipidi (GSL) appartengono alla classe di glicoconiugato biomacromolecole, che portano le informazioni strutturali di importanti processi biologici quali lo sviluppo embrionale, la trasduzione del segnale, e il riconoscimento del recettore immunitario 1-2. Essi contengono frazioni di zucchero complessi in forma di isomeri e frazioni di lipidi con variazioni comprese lunghezza grassi a catena acilica, insaturazione, e idrossilazione. Entrambe le porzioni di carboidrati e ceramide possono essere base di significato biologico. Per esempio, tri-hexosylceramides includono globotriaosilceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), che hanno masse molecolari identiche ma collegamenti zucchero distinti di parte di carboidrato, responsabile delle funzioni biologiche completamente diverse 3-4. In un altro esempio, è stato dimostrato che la modifica della parte ceramide di alfa-galactosylceramide, un ligando potente agonista per invariformica cellule NKT, cambi i loro profili di secrezione di citochine e la funzione in modelli animali di cancro e malattie autoimmuni 5. La difficoltà di eseguire una analisi strutturale di isomeri in organi e cellule immunitarie fungere da barriera per determinare molte funzioni biologiche 6.
Qui, presentiamo una versione visualizzata di un metodo per l'analisi relativamente semplice, rapido e sensibile di profili glicosfingolipidi nelle cellule immunitarie 7-9. Questo metodo si basa sulla modificazione estrazione e chimica (permethylation, vedi sotto figura 5A, tutti i gruppi OH di esosi sono stati sostituiti da MeO dopo reazione permethylation) di glicosfingolipidi 10-15, seguita da analisi successive utilizzando matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione time- di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS) e spettrometria di massa di ioni trappola. Questo metodo richiede 50 milioni di cellule immunitarie per un'analisi completa. Gli esperimenti possono essere completate entro una settimana. L'abbondanza relativa dei glicosfingolipidi varie possono essere delineati rispetto agli standard di sintesi. Questo metodo ha una sensibilità di misurazione 1% iGb3 tra Gb3 isomeri, quando due fmol del totale iGb3/Gb3 miscela è presente 9.
Spettrometria di massa a trappola ionica può essere utilizzato per analizzare isomeri. Ad esempio, per analizzare la presenza di globotriaosilceramide e isoglobtriaosylceramide nello stesso campione, si può usare la frammentazione di molecole strutturalmente glicosfingolipidi di discriminare tra i due (vedi sotto Figura 5). Inoltre, la modificazione chimica delle frazioni di zucchero (tramite una reazione permethylation) migliora la ionizzazione e l'efficienza di frammentazione di maggiore sensibilità e specificità, e aumenta la stabilità di residui di acido sialico. La modificazione chimica di estrazione e glicosfingolipidi può essere eseguita in un classico cappa chimica certificata, e la spettrometria di massa può essere eseguita da nucleoimpianti con trappola ionica strumenti MS.
Il glycome, un termine coniato in analogia al genoma e del proteoma, si riferisce a tutte le strutture di un organismo saccaridi. Per comprendere pienamente le molteplici funzioni della glicosilazione richiederà un approccio integrato che comprende entrambi gli studi funzionali e strutturali glicomica. Entrambi sono complicate dal non-template natura driven di biosintesi glicano, la conseguente complessità e la diversità delle strutture glycan, frequente coinvolgimento di struttura aglicone nel modulare glycan interazioni ligando-recettore a livello molecolare, e l'importanza funzionale di ligandi poco abbondanti.
E 'generalmente accettato che la spettrometria di massa (MS) è un metodo indispensabile per studi strutturali glicomica, soprattutto per identificare e caratterizzare ligandi poco abbondanti. Per osservare glicani o glicoconiugati come specie molecolari, che spesso utilizza una ad alta efficienza, bassa energia di ionizzazione metodo, chiamato ionizzazione elettrospray (ESI). Per maggiori detaffliggesse caratterizzazione della struttura glicano, è essenziale selezionare singole specie molecolari e rompere i glicani in piccoli pezzi. Questo avviene normalmente in seguito a collisione indotta dissociazione, che prevede l'attivazione dei glicani di collisioni con le molecole di gas inerti. L'aumento di energia induce rottura legame, e l'analisi sistematica dei frammenti risultanti fornisce informazioni sulla struttura molecolare del glicano. Spesso, "firma" frammenti possono essere generati che sono diagnostici per particolari caratteristiche glycan strutturali. Insieme con la massa molecolare, questi frammenti possono talvolta essere sufficienti per identificare glicani, ma in passato molte più informazioni è stato richiesto per caratterizzare pienamente, in particolare se la struttura è nuova. Questi metodi comprendono analisi della composizione dello zucchero, l'analisi dei gas cromatografia spettrometria di massa parzialmente metilati acetati alditolo per analisi di linkage, e la digestione glicosidasi specifiche 17.
<p class="Jove_content"> Come è stato dimostrato negli ultimi dieci anni 18-19, vari cicli di frammentazione bassa energia, che può essere svolta effettivamente in una trappola ionica spettrometro di massa (IT-MS), migliora notevolmente la resa informazioni dall'analisi spettrale di massa glicano . Con quattro o cinque giri di frammentazione (che non può essere fatto con altri strumenti MS), è possibile distinguere glicani isomeriche che contengono i componenti zucchero stessi disposti in legami zucchero differenti, anche quando questi sono presenti insieme in miscele di componenti con la stessa massa molecolare (isobare). Per questa analisi, i glicani erano derivatizzato, in sostituzione di tutti i gruppi ossidrilici liberi con gruppi metilici, usando permethylation. Mentre l'assegnazione strutturale dei glicani è possibile senza permethylation, il permethylation aumenta la sensibilità 17.Levery e Zhou, hanno unito tutti i vantaggi potenziali di IT-MS metodologia, compresa l'individuazione delle isomerica structures utilizzando ioni firma diagnostici, osservabili solo in MS 4 e MS 5 spettri, per l'identificazione ad alta sensibilità e la quantificazione di glicosfingolipidi presenti in forma di miscele multiple isobariche 7-9. In teoria, si può essere in grado di identificare ogni struttura esistente glicolipidi, in attesa della disponibilità di glicolipidi standard, che possono essere sintetizzati chimicamente.
I passi fondamentali di questa analisi sono il tasso di recupero GSLs da campioni biologici. Tipicamente 80 pg di GSL può essere recuperato da 100 milioni di cellule tumorali come RBL. Per generare sufficienti ioni molecolari per vari cicli di frammentazione in trappola ionica spettrometri di massa, almeno 10 microgrammi di GSLs tumorali sono obbligatori. Bassa resa di GSLs durante la purificazione porterà a bassa abbondanza di ioni, che non possono essere sottoposti a un'ulteriore frammentazione. Il successo dell'analisi dipende dalla quantità di GSLs che vengono recuperati. In genere, finale concentration di GSLs permethylated dovrebbe raggiungere 1 mg / ml, disciolto in metanolo, prima di essere analizzato su un nano-elettrospray sorgente. Il limite per una approfondita analisi MS n dipende l'abbondanza di ione specifico in MS 1 profilo. Un tipico e 7 abbondanza di ioni è richiesto per una approfondita analisi MS 5. La bassa resa di GSLs durante la purificazione può essere causata dalla perdita di GSLs durante la fase peracetylation (che rimuove i fosfolipidi), quando le per-acetilati GSLs deve essere associato a cromatografia su colonna di resina Florisil, lavato, e successivamente eluito. Per garantire il legame di per-acetilati GSLs al gel di silice, i campioni dovrebbero essere ricaricato due volte alla colonna di cromatografia dopo scorre attraverso.
The authors have nothing to disclose.
DZ è supportato dal MD Anderson Cancer Center e sovvenzioni NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center è supportato in parte dal NIH sovvenzione CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |