Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.
Glycosfingolipiden (GSL's) behoren tot de klasse van Glycoconjugaat biomacromoleculen die structurele informatie voor belangrijke biologische processen zoals embryonale ontwikkeling, signaaltransductie en immune receptorherkenning 1-2 dragen. Ze bevatten complex suikereenheden in de vorm van isomeren en lipide groepen met variaties zoals vet acyl ketenlengte, onverzadiging en hydroxylering. Zowel koolhydraten en ceramide delen kunnen basis van biologische betekenis. Bijvoorbeeld tri-hexosylceramides omvatten globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) en isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) die identieke moleculaire massa maar verschillende suikerkoppelingen van koolhydraatonderdeel verantwoordelijk voor totaal verschillende biologische functies hebben 3-4. In een ander voorbeeld is aangetoond dat modificatie van de ceramide van alpha-galactosylceramide, een krachtige agonist ligand voor invariant NKT cellen, verandert hun cytokine secretie profielen en functie in diermodellen van kanker en auto-immuunziekten 5. De moeilijkheid bij het uitvoeren van een structurele analyse van isomeren in immune organen en cellen dienen als een barrière voor het bepalen van vele biologische functies 6.
Hier geven we een gevisualiseerde uitvoeringsvorm van een werkwijze voor relatief eenvoudige, snelle en gevoelige analyse van glycosfingolipiden profielen in immuuncellen 7-9. Deze methode is gebaseerd op extractie en chemische modificatie (permethylation, zie figuur 5A hieronder, alle OH groepen zijn vervangen door hexose MeO na permethylation reactie) van glycosfingolipiden 10-15, gevolgd door daaropvolgende analyse met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time- of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS) en ion trap massaspectrometrie. Deze methode vereist 50000000 immuuncellen voor een volledige analyse. De experimenten kan worden voltooid binnen een week. De relatieve hoeveelheden van de verschillende glycosfingolipiden worden afgebakend door vergelijking met synthetische normen. Deze methode heeft een gevoeligheid van 1% meten iGb3 onder Gb3 isomeren toen 2 fmol totale iGb3/Gb3 mengsel aanwezig 9.
Ion trap massaspectrometrie kan gebruikt worden om isomeren te analyseren. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van globotriaosylceramide en isoglobtriaosylceramide in hetzelfde monster te analyseren, kan men de fragmentatie van glycosfingolipiden moleculen structureel onderscheid tussen beide (zie hieronder figuur 5). Bovendien chemische modificatie van de suikergroepen (via een permethylation reactie) verbetert de ionisatie en fragmentatie efficiëntie voor een grotere gevoeligheid en specificiteit, en verhoogt de stabiliteit van siaalzuurresten. De extractie en chemische modificatie van glycosfingolipiden kan worden uitgevoerd in een gecertificeerde klassieke chemische afzuigkap en massaspectrometrie kan door kernfaciliteiten met ion trap MS instrumenten.
De glycome, een term die in analogie met het genoom en proteoom, verwijst naar alle saccharide structuren van een organisme. Om volledig te begrijpen het spruitstuk functies van glycosylering vereist een geïntegreerde aanpak waarin zowel functionele en structurele glycomics studies. Beide worden gecompliceerd door de non-template gerichte aard van glycan biosynthese de resulterende complexiteit en diversiteit van glycaanstructuren, er vaak van aglycone structuur moduleren glycan ligand-receptor interacties op moleculair niveau en het functionele belang van lage abundantie liganden.
Het is algemeen aanvaard dat massaspectrometrie (MS) is een onmisbare methode voor structurele studies glycomics, met name voor het identificeren en karakteriseren lage abundantie liganden. Om glycanen of glycoconjugaten als moleculaire species te observeren, maken we vaak gebruik van een zeer efficiënte, lage energie ionisatie methode, genaamd electrospray ionisatie (ESI). Meer detscheelde karakterisering van glycan structuur, is het essentieel om individuele moleculaire species selecteren en de glycanen breken in kleinere stukken. Dit wordt meestal gedaan door middel van botsing-geïnduceerde dissociatie, wat inhoudt dat het activeren van de glycanen door botsing met inert gas moleculen. De toegenomen energie induceert band breuk, en systematische analyse van de resulterende fragmenten geeft informatie over de moleculaire structuur van de glycan. Vaak kunnen "handtekening" fragmenten worden gegenereerd dat diagnostische zijn voor bepaalde glycan structurele kenmerken. Samen met de molecuulmassa Deze fragmenten kunnen soms voldoende voor het identificeren glycanen, maar in het verleden veel informatie nodig om volledig te karakteriseren, vooral als de structuur roman. Deze methoden bestaan uit suiker samenstelling analyse, gaschromatografie massaspectrometrie analyse van gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten voor linkage analyse en specifieke glycosidase spijsvertering 17.
<p class="Jove_content"> Zoals aangetoond in het afgelopen decennium 18-19, meerdere ronden van lage energie fragmentatie, die effectief kan worden uitgevoerd in een ion-trap massaspectrometer (IT-MS), verbetert de opbrengst van informatie glycan massaspectrale analyse . Met vier of vijf keer fragmentatie (die niet kan worden gedaan met andere MS instrumenten), is te onderscheiden isomere glycanen die dezelfde suikercomponenten gerangschikt in verschillende suikerkoppelingen bevatten, zelfs wanneer deze samen aanwezig in mengsels van componenten met dezelfde moleculaire massa (isobaren). Voor deze analyse de glycanen werden gederivatiseerd, ter vervanging van alle vrije hydroxylgroepen met methylgroepen met permethylation. Terwijl structurele toewijzing van de glycanen is mogelijk zonder permethylation, de permethylation verhoogt de gevoeligheid 17.Levery en Zhou, hebben samen alle potentiële voordelen van IT-MS methode, zoals de detectie van isomere structures met signature diagnostische ionen, die slechts in 4 en MS MS spectra 5, voor de zeer gevoelige identificatie en kwantificering van glycosfingolipiden aanwezig in de vorm van meerdere isobare mengsels 7-9. In theorie kunnen we in staat zijn om elk bestaand glycolipide structuur te identificeren, in afwachting van de beschikbaarheid van standaard glycolipiden, die chemisch gesynthetiseerd kunnen worden.
De kritische stappen van deze analyse zijn de opbrengst van GSLs uit biologische monsters. Typisch 80 ug van GSL kan worden teruggevorderd van 100 miljoen tumorcellen, zoals RBL. Om voldoende moleculaire ionen voor meerdere ronden van fragmentatie in ion-trap massaspectrometers genereren, ten minste 10 microgram van tumor GSLs vereist. Lage opbrengst van GSLs gedurende zuivering leidt tot geringe hoeveelheden ionen, die niet konden worden onderworpen aan verdere fragmentatie. Het succes van de analyse is afhankelijk van de hoeveelheid GSLs die worden teruggewonnen. Typisch, eindconcentration van permethylated GSLs moet tot 1 mg / ml, opgelost in methanol, alvorens geanalyseerd op een nano-electrospray bron. De grens voor een grondige analyse MS n is afhankelijk van de hoeveelheden van specifieke ionen in MS 1 profiel. Een typische e 7 ion overvloed is voor een grondig MS 5 analyse. De lage opbrengst van GSLs tijdens zuivering kan worden veroorzaakt door verminderde GSLs tijdens peracetylation stap (waardoor de fosfolipiden), wanneer de per-geacetyleerde GSLs is gebonden aan Florisil hars chromatografiekolom, gewassen en vervolgens geëlueerd. De binding van per-geacetyleerd GSLs op silicagel waarborgen, moeten de monsters tweemaal geladen om de chromatografiekolom na doorstromen.
The authors have nothing to disclose.
DZ wordt ondersteund door MD Anderson Cancer Center en NIH subsidies AI079232. MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |