Специфичным и чувствительным методом, чтобы разобраться в выражении профиль гликосфинголипид антигенов в органах иммунной системы и клеток описано. Метод использует масс-спектрометрии ионной ловушки позволяет поэтапно фрагментации молекулы гликосфинголипид для структурного анализа, по сравнению с химически синтезированными стандартам.
Glycosphingolipids (GSL’s) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.
Glycome, термин, введенный по аналогии с геномом и протеома, относится ко всем сахарида структур организма. Чтобы в полной мере понять многообразие функций гликозилирования требуют комплексного подхода, включая функциональные и структурные glycomics исследований. Оба осложняется не-управляемых с помощью шаблонов характер гликана биосинтеза, в результате сложность и многообразие структур гликанов, частое участие агликона структуры в модуляции гликана лиганд-рецепторных взаимодействий на молекулярном уровне, и функциональное значение низкого лигандов изобилия.
Принято считать, что масс-спектрометрии (МС) является незаменимым методом для структурных исследований glycomics, особенно для идентификации и характеристике низкой лигандов изобилия. Для наблюдения гликанов или гликоконъюгатов в качестве молекулярных видов, мы часто используем высокую эффективность, низкую энергию ионизации метод, называемый ионизации электрораспылением (ESI). Для получения дополнительной Detбеспокоило характеристику структуры гликанов, она имеет важное значение для выбора отдельных видов молекул и сломать гликанов на более мелкие куски. Обычно это делается при столкновении вызванной диссоциации, которая включает в себя активацию гликанов через столкновение с молекул инертного газа. Увеличение энергии вызывает разрыва связей, и систематический анализ полученных фрагментов предоставляет информацию о молекулярной структуре гликана. Часто, "подпись" фрагменты могут быть созданы, которые являются диагностическими для конкретного гликана структурные особенности. Вместе с молекулярной массой, эти фрагменты могут иногда быть достаточным для идентификации гликаны, но в прошлом гораздо больше информации, было необходимо, чтобы полностью охарактеризовать их, особенно если структура романа. Эти методы включают сахара анализа состава, газовой хроматографии масс-спектрометрии анализа частично метилированные alditol ацетаты для анализа сцепления, а также конкретные пищеварения гликозидазой 17.
<p class="Jove_content"> Как показала за последние десять лет 18-19, несколько раундов низкой фрагментации энергии, которая может быть эффективно осуществлены в ионной ловушки масс-спектрометр (IT-MS), значительно улучшает информации выходом из гликана масс-спектрального анализа . С четырех или пяти раундов фрагментации (которая не может быть сделано с другими документами MS), можно различить изомерные гликанов, которые содержат те же компоненты, сахар, расположенных в различных связей сахар, даже если они находятся вместе в смеси компонентов с теми же Молекулярная масса (изобары). Для этого анализа гликанов были производные, заменой всех свободных гидроксильных групп с использованием метильных групп permethylation. В то время как структурное назначение гликанов возможно без permethylation, permethylation повышает чувствительность 17.Levery и Чжоу, объединили все потенциальные преимущества IT-MS методологии, включая обнаружение изомерных STRUctures использования сигнатурных диагностических ионов, наблюдается только в MS 4 и MS 5 спектров для высокочувствительных идентификации и количественного определения гликосфинголипиды присутствует в виде нескольких изобарических смеси 7-9. В теории, мы можем быть в состоянии идентифицировать каждую существующую структуру гликолипидов, до предоставления стандартных гликолипиды, которые могут быть химически синтезированы.
Важных шагов этого анализа являются скорость восстановления GSLs из биологических образцов. Обычно 80 мкг GSL могут быть восстановлены со 100 млн. опухолевых клеток, таких как RBL. Для создания достаточной молекулярных ионов для нескольких раундов фрагментации в ионной ловушки масс-спектрометры, по меньшей мере 10 микрограмм опухоли GSLs не требуется. Низкая доходность GSLs во время очистки приведет к низкой численности ионов, которые не могут быть подвергнуты дальнейшей фрагментации. Успех анализа зависит от количества GSLs, которые выздоровели. Как правило, конечная концентрацияentration из permethylated GSLs должна достигать 1 мг / мл, растворяют в метаноле, перед проанализированы на нано-электрораспылением источник. Предел для тщательного анализа MS п зависит от обилия конкретных ионов в MS 1 анкету. Типичный E 7 ионный изобилия, необходимую для тщательного анализа MS 5. Низкий выход GSLs во время очистки может быть вызвано потерей GSLs во время peracetylation шаг (который удаляет фосфолипидов), когда за ацетилированный GSLs должен быть привязан к Florisil колоночной хроматографии смолы, промывают, а затем элюировали. Чтобы обеспечить связывание за ацетилированный GSLs на силикагеле, образцы должны быть перегружены в два раза к колоночной хроматографии после прохождения через.
The authors have nothing to disclose.
DZ поддерживают MD Anderson Cancer Center и гранты NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center будет частично поддержана NIH грант CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |