Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

Summary

Este protocolo describe una técnica para la generación cíbrida a partir de células cancerosas en suspensión como una herramienta para estudiar el papel de las mitocondrias en el proceso tumorigénico.

Abstract

En los últimos años, el número de estudios dedicados a determinar la conexión entre las mitocondrias y el cáncer ha aumentado significativamente. Sin embargo, aún se necesitan más esfuerzos para comprender completamente el vínculo que implica alteraciones en las mitocondrias y la tumorigénesis, así como para identificar fenotipos mitocondriales asociados a tumores. Por ejemplo, para evaluar la contribución de las mitocondrias en los procesos de tumorigénesis y metástasis, es esencial comprender la influencia de las mitocondrias de las células tumorales en diferentes entornos nucleares. Para este propósito, un posible enfoque consiste en transferir mitocondrias a un fondo nuclear diferente para obtener las llamadas células cíbridas. En las técnicas tradicionales de cibridización, una línea celular que carece de ADNmt (ρ⁰, célula donante nuclear) se repoblina con mitocondrias derivadas de células enucleadas o plaquetas. Sin embargo, el proceso de enucleación requiere una buena adhesión celular a la placa de cultivo, una característica que se pierde parcial o completamente en muchos casos en las células invasivas. Además, otra dificultad encontrada en los métodos tradicionales es lograr la eliminación completa del ADNmt endógeno de la línea celular receptora mitocondrial para obtener fondos de ADN nuclear y mitocondrial puro, evitando la presencia de dos especies diferentes de ADNmt en el cíbrida generado. En este trabajo, presentamos un protocolo de intercambio mitocondrial aplicado a células cancerosas de crecimiento en suspensión basado en la repoblación de células pretratadas con rodamina 6G con mitocondrias aisladas. Esta metodología nos permite superar las limitaciones de los enfoques tradicionales, y por lo tanto puede ser utilizada como una herramienta para ampliar la comprensión del papel mitocondrial en la progresión del cáncer y la metástasis.

Introduction

La reprogramación del metabolismo energético es un sello distintivo del cáncer¹ que fue observado por primera vez por Otto Warburg en la década de 1930². En condiciones aeróbicas, las células normales convierten la glucosa en piruvato, que luego genera acetil-coA, alimentando la maquinaria mitocondrial y promoviendo la respiración celular. Sin embargo, Warburg demostró que, incluso en condiciones normóxicas, la mayoría de las células cancerosas convierten el piruvato obtenido del proceso de glucólisis en lactato, cambiando su forma de obtener energía. Este ajuste metabólico se conoce como el “efecto Warburg” y permite a algunas células cancerosas satisfacer sus demandas energéticas para un rápido crecimiento y división, a pesar de generar ATP de manera menos eficiente que el proceso aeróbico ^3,4,5. En las últimas décadas, numerosos trabajos han apoyado la implicación de la reprogramación del metabolismo en la progresión del cáncer. Por lo tanto, la energética tumoral se considera un objetivo interesante contra el cáncer¹. Como eje central en el metabolismo energético y en el suministro de precursores esenciales, las mitocondrias juegan un papel clave en estas adaptaciones celulares que, hasta la fecha, solo entendemos parcialmente.

En línea con lo anterior, las mutaciones del ADN mitocondrial (ADNmt) han sido propuestas como una de las posibles causas de esta reprogramación metabólica, lo que podría conducir a un deterioro del rendimiento de la cadena de transporte de electrones (ETC)⁶ y explicaría por qué algunas células cancerosas mejoran su metabolismo glucolítico para sobrevivir. De hecho, se ha relatado que el ADNmt acumula mutaciones dentro de las células cancerosas, estando presente en al menos el 50% de los tumores⁷. Por ejemplo, un estudio reciente realizado por Yuan et al. reportó la presencia de moléculas de ADNmt hipermutadas y truncadas en cánceres de riñón, colorrectal y tiroides⁸. Además, muchos trabajos han demostrado que ciertas mutaciones del ADNmt están asociadas con un fenotipo tumoral más agresivo y con un aumento del potencial metastásico de las células cancerosas 9,10,11,12,13,14,15,16.

A pesar de la aparente relevancia del genoma mitocondrial en la progresión del cáncer, el estudio de estas mutaciones y su contribución a la enfermedad han sido desafiantes debido a las limitaciones en los modelos experimentales y tecnologías actualmente disponibles¹⁷. Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas para comprender el impacto real del ADN de las mitocondrias en el desarrollo y la progresión de la enfermedad del cáncer. En este trabajo, introducimos un protocolo para la generación de cíbridos transmitocondriales a partir de células cancerosas en crecimiento en suspensión, basado en la repoblación de células pretratadas con rodamina 6G con mitocondrias aisladas, que supera los principales desafíos de los métodos tradicionales de cibridización^18,19. Esta metodología permite el uso de cualquier núcleo donante independientemente de la disponibilidad de su correspondiente línea celular ρ⁰ y la transferencia de mitocondrias a partir de células que, siguiendo las técnicas tradicionales, serían difíciles de enuclear (es decir, líneas celulares no adherentes).

Protocol

NOTA: Todos los medios de cultivo y composiciones de búfer se especifican en la Tabla 1. Antes de la generación cíbrida, se deben tipificar los perfiles de ADN mitocondrial y nuclear de las células donante y receptora para confirmar la presencia de diferencias genéticas en ambos genomas entre las líneas celulares. En este estudio, se utilizó una línea celular L929 disponible comercialmente y su línea celular derivada, L929dt, que se generó espontáneamente en nuestro laboratorio (ver<sup class=…

Representative Results

Después de seguir el protocolo presentado anteriormente, se debe obtener una línea celular ciclaria homoplásmica con un fondo nuclear conservado pero con un nuevo genotipo mitocondria, como se representa en los esquemas de la Figura 1 y la Figura 2. La pureza del ADN mitocondrial y nuclear presente en los cíbridos puede confirmarse mediante RFLP, como se muestra en la Figura 3, y mediante análisis de genotipado de ADN nuclear, …

Discussion

Desde que Otto Warburg informó que las células cancerosas cambian su metabolismo y potencian la “glucólisis aeróbica”^3,4 mientras reducen la respiración mitocondrial^, el interés en el papel de las mitocondrias en la transformación y progresión del cáncer ha crecido exponencialmente. En los últimos años, las mutaciones en el ADNmt y la disfunción mitocondrial han sido postuladas como características de muchos tipos de cáncer²⁵…

Materials

3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750