يصف هذا البروتوكول تقنية لتوليد السايبريد من الخلايا السرطانية المعلقة كأداة لدراسة دور الميتوكوندريا في عملية الورم.
في السنوات الأخيرة ، ارتفع عدد الدراسات المخصصة للتأكد من العلاقة بين الميتوكوندريا والسرطان بشكل كبير. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الجهود لفهم العلاقة التي تنطوي على تغييرات في الميتوكوندريا وتكوين الأورام بشكل كامل ، وكذلك لتحديد الأنماط الظاهرية للميتوكوندريا المرتبطة بالورم. على سبيل المثال ، لتقييم مساهمة الميتوكوندريا في عمليات تكوين الأورام وورم خبيث ، من الضروري فهم تأثير الميتوكوندريا من الخلايا السرطانية في البيئات النووية المختلفة. لهذا الغرض ، يتمثل أحد الأساليب الممكنة في نقل الميتوكوندريا إلى خلفية نووية مختلفة للحصول على ما يسمى بالخلايا السايبريدية. في تقنيات cybridization التقليدية ، يتم إعادة ملء خط الخلية الذي يفتقر إلى mtDNA (ρ0 ، خلية مانحة نووية) بالميتوكوندريا المشتقة من الخلايا المنزوعة النواة أو الصفائح الدموية. ومع ذلك ، تتطلب عملية الاستئصال التصاق جيد للخلايا بلوحة المزرعة ، وهي ميزة تفقد جزئيا أو كليا في كثير من الحالات في الخلايا الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك صعوبة أخرى موجودة في الطرق التقليدية وهي تحقيق الإزالة الكاملة ل mtDNA الداخلي من خط الخلية المتلقي للميتوكوندريا للحصول على خلفيات الحمض النووي والميتوكوندريا النقية ، وتجنب وجود نوعين مختلفين من mtDNA في cybrid المتولد. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول تبادل الميتوكوندريا المطبق على الخلايا السرطانية المعلقة النمو بناء على إعادة توطين الخلايا المعالجة مسبقا للرودامين 6G مع الميتوكوندريا المعزولة. تسمح لنا هذه المنهجية بالتغلب على قيود الأساليب التقليدية ، وبالتالي يمكن استخدامها كأداة لتوسيع فهم دور الميتوكوندريا في تطور السرطان وورم خبيث.
إعادة برمجة استقلاب الطاقة هو السمة المميزة للسرطان1 التي لوحظت لأول مرة من قبل أوتو واربورغ في ثلاثينيات القرن العشرين2. في ظل الظروف الهوائية ، تقوم الخلايا الطبيعية بتحويل الجلوكوز إلى بيروفات ، والتي تولد بعد ذلك أسيتيل-CoA ، مما يغذي آلية الميتوكوندريا ويعزز التنفس الخلوي. ومع ذلك ، أظهر واربورغ أنه حتى في ظل الظروف المعيارية ، تقوم معظم الخلايا السرطانية بتحويل البيروفات التي تم الحصول عليها من عملية تحلل السكر إلى لاكتات ، وتحول طريقها للحصول على الطاقة. يعرف هذا التعديل الأيضي باسم “تأثير واربورغ” ويمكن بعض الخلايا السرطانية من توفير مطالبها النشطة للنمو السريع والانقسام ، على الرغم من توليد ATP بكفاءة أقل من العملية الهوائية3،4،5. في العقود الأخيرة ، دعمت العديد من الأعمال الآثار المترتبة على إعادة برمجة الأيض في تطور السرطان. وبالتالي ، تعتبر طاقة الورم هدفا مثيرا للاهتمام ضد السرطان1. كمحور مركزي في التمثيل الغذائي النشط وفي توريد السلائف الأساسية ، تلعب الميتوكوندريا دورا رئيسيا في هذه التكيفات الخلوية التي ، حتى الآن ، نفهمها جزئيا فقط.
تماشيا مع ما سبق ، تم اقتراح طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) كأحد الأسباب المحتملة لإعادة البرمجة الأيضية هذه ، والتي يمكن أن تؤدي إلى ضعف أداء سلسلة نقل الإلكترون (ETC)6 وستفسر سبب تعزيز بعض الخلايا السرطانية لعملية التمثيل الغذائي للسكر للبقاء على قيد الحياة. في الواقع ، تم الإبلاغ عن أن mtDNA يتراكم الطفرات داخل الخلايا السرطانية ، حيث يوجد في 50٪ على الأقل من الأورام7. على سبيل المثال ، أفادت دراسة حديثة أجراها Yuan et al. بوجود جزيئات mtDNA مفرطة التحور والمقطوعة في سرطان الكلى والقولون والمستقيم والغدة الدرقية8. علاوة على ذلك ، أثبتت العديد من الأعمال أن بعض طفرات mtDNA مرتبطة بنمط ظاهري أكثر عدوانية للورم ومع زيادة في الإمكانات النقيلية للخلايا السرطانية9،10،11،12،13،14،15،16.
على الرغم من الأهمية الواضحة لجينوم الميتوكوندريا في تطور السرطان ، فإن دراسة هذه الطفرات ومساهمتها في المرض كانت صعبة بسبب القيود في النماذج والتقنيات التجريبية المتاحة حاليا17. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لفهم التأثير الحقيقي للحمض النووي للميتوكوندريا في تطور مرض السرطان وتطوره. في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا لتوليد cybrid transmitochondrial من الخلايا السرطانية المعلقة النمو ، استنادا إلى إعادة توطين خلايا الرودامين 6G المعالجة مسبقا مع الميتوكوندريا المعزولة ، والتي تتغلب على التحديات الرئيسية لطرق cybridization التقليدية18,19. تسمح هذه المنهجية باستخدام أي متبرع بالنوى بغض النظر عن توفر خط الخلية ρ0 المقابل ونقل الميتوكوندريا من الخلايا التي ، باتباع التقنيات التقليدية ، سيكون من الصعب استئصالها (أي خطوط الخلايا غير الملتصقة).
منذ أن أفاد أوتو واربورغ أن الخلايا السرطانية تحول عملية التمثيل الغذائي وتحفز “تحلل السكر الهوائي”3,4 مع تقليل تنفس الميتوكوندريا ، نما الاهتمام بدور الميتوكوندريا في تحول السرطان وتطوره بشكل كبير. في السنوات الأخيرة ، تم افتراض الطفرات في mtDNA واختلال المي?…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا البحث من خلال المنحة رقم PID2019-105128RB-I00 إلى RSA و JMB و AA ، و PGC2018-095795-B-I00 إلى PFS و RML ، وكلاهما ممول من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 وأرقام المنح B31_20R (RSA و JMA و AA) و E35_17R (PFS و RML) وبتمويل من Gobierno de Aragón. وحظي عمل الرابطة بدعم من منحة من الرابطة الإسبانية لمكافحة الكانسر PRDAR21487SOLE. ويود المؤلفان أن يعربا عن تقديرهما لاستخدام الخدمة العامة للدعم والتحقيق في الأجهزة العليا للرقابة المالية، جامعة سرقسطة.
3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
Boric acid | PanReac | 131015 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
EDTA | PanReac | 131026 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
Geneticin | Gibco | 10131027 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
SspI | New England Biolabs | R3132 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris | PanReac | P14030b | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |