В этом протоколе описывается метод генерации цибрид из раковых клеток, растущих в суспензии, в качестве инструмента для изучения роли митохондрий в онкогенном процессе.
В последние годы значительно возросло количество исследований, посвященных выяснению связи между митохондриями и раком. Тем не менее, все еще необходимы дополнительные усилия, чтобы полностью понять связь, связанную с изменениями в митохондриях и онкогенезе, а также для выявления митохондриальных фенотипов, связанных с опухолью. Например, чтобы оценить вклад митохондрий в процессы онкогенеза и метастазирования, важно понять влияние митохондрий опухолевых клеток в различных ядерных средах. Для этой цели один из возможных подходов состоит в переносе митохондрий в другой ядерный фон для получения так называемых клеток кибридов. В традиционных методах цибридизации клеточная линия, лишенная мтДНК (ρ0, ядерная донорская клетка), заселяется митохондриями, полученными либо из энуклеированных клеток, либо из тромбоцитов. Однако процесс энуклеации требует хорошей клеточной адгезии к культуральной пластине, особенность, которая частично или полностью теряется во многих случаях в инвазивных клетках. Кроме того, еще одна трудность, встречающаяся в традиционных методах, заключается в достижении полного удаления эндогенной мтДНК из клеточной линии митохондрий-реципиентов для получения чистых ядерных и митохондриальных фонов ДНК, избегая присутствия двух разных видов мтДНК в сгенерированном цибриде. В этой работе мы представляем протокол митохондриального обмена, применяемый к раковым клеткам, выращивающим суспензию, на основе репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями. Эта методология позволяет преодолеть ограничения традиционных подходов и, таким образом, может быть использована в качестве инструмента для расширения понимания роли митохондрий в прогрессировании рака и метастазировании.
Перепрограммирование энергетического метаболизма является отличительной чертой рака1, который впервые наблюдался Отто Варбургом в 1930-х годах2. В аэробных условиях нормальные клетки превращают глюкозу в пируват, который затем генерирует ацетил-КоА, подпитывая митохондриальный механизм и способствуя клеточному дыханию. Тем не менее, Варбург продемонстрировал, что даже в нормоксических условиях большинство раковых клеток превращают пируват, полученный в процессе гликолиза, в лактат, изменяя свой путь к получению энергии. Эта метаболическая корректировка известна как «эффект Варбурга» и позволяет некоторым раковым клеткам удовлетворять свои энергетические потребности для быстрого роста и деления, несмотря на то, что генерация АТФ менее эффективна, чем аэробный процесс 3,4,5. В последние десятилетия многочисленные работы подтвердили влияние перепрограммирования метаболизма на прогрессирование рака. Следовательно, опухолевая энергетика считается интересной мишенью против рака1. Как центральный узел в энергетическом метаболизме и в поставке необходимых предшественников, митохондрии играют ключевую роль в этих клеточных адаптациях, которые на сегодняшний день мы понимаем лишь частично.
В соответствии с вышесказанным, мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) были предложены в качестве одной из возможных причин этого метаболического перепрограммирования, что может привести к нарушению производительности цепи переноса электронов (ETC)6 и объяснить, почему некоторые раковые клетки усиливают свой гликолитический метаболизм, чтобы выжить. Действительно, сообщалось, что мтДНК накапливает мутации в раковых клетках, присутствуя, по крайней мере, в 50% опухолей7. Например, в недавнем исследовании, проведенном Yuan et al., сообщалось о наличии гипермутированных и усеченных молекул мтДНК при раке почек, толстой кишки и щитовидной железы8. Более того, во многих работах было продемонстрировано, что определенные мутации мтДНК связаны с более агрессивным фенотипом опухоли и с увеличением метастатического потенциала раковых клеток 9,10,11,12,13,14,15,16.
Несмотря на очевидную значимость митохондриального генома в прогрессировании рака, изучение этих мутаций и их вклада в заболевание было сложным из-за ограничений в экспериментальных моделях и технологиях, доступных в настоящее время17. Таким образом, необходимы новые методы для понимания реального влияния митохондриальной ДНК на развитие и прогрессирование раковых заболеваний. В этой работе мы представляем протокол генерации трансмитохондриальных цибридов из раковых клеток, растущих в суспензии, основанный на репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями, что позволяет преодолеть основные проблемы традиционных методов кибридизации18,19. Эта методология позволяет использовать любого донора ядер независимо от наличия соответствующей им клеточной линии ρ0 и переноса митохондрий из клеток, которые, следуя традиционным методам, было бы трудно энуклеировать (т.е. неадгезивные клеточные линии).
С тех пор, как Отто Варбург сообщил, что раковые клетки изменяют свой метаболизм и потенцируют «аэробный гликолиз»3,4 при одновременном снижении митохондриального дыхания, интерес к роли митохондрий в трансформации и прогрессировании рака вырос в геомет…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось грантом No PID2019-105128RB-I00 для RSA, JMB и AA и PGC2018-095795-B-I00 для PFS и RML, оба финансировались MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 и грантами No B31_20R (RSA, JMA и AA) и E35_17R (PFS и RML) и финансировались Gobierno de Aragón. Работа ЮАР была поддержана грантом Испанской ассоциации против кансера (AECC) PRDAR21487SOLE. Авторы хотели бы отметить использование Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
Boric acid | PanReac | 131015 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
EDTA | PanReac | 131026 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
Geneticin | Gibco | 10131027 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
SspI | New England Biolabs | R3132 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris | PanReac | P14030b | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |