פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.
בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ0, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.
תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן1 שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים2. בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם “אפקט ורבורג” ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי 3,4,5. בעשורים האחרונים, עבודות רבות תמכו במשמעות של תכנות מחדש של חילוף החומרים בהתקדמות הסרטן. לפיכך, אנרגיית הגידול נחשבת למטרה מעניינת נגד סרטן1. כמרכז מרכזי בחילוף חומרים אנרגטי ובאספקת מבשרים חיוניים, מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מפתח בהסתגלויות התאים הללו, שעד היום אנו מבינים רק באופן חלקי.
בהתאם לאמור לעיל, מוטציות DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) הוצעו כאחד הגורמים האפשריים לתכנות מחדש מטבולי זה, אשר עלול להוביל לפגיעה בביצועי שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC)6 ויסבירו מדוע תאים סרטניים מסוימים משפרים את חילוף החומרים הגליקוליטי שלהם כדי לשרוד. ואכן, דווח כי mtDNA צובר מוטציות בתוך תאים סרטניים, להיות נוכח לפחות 50% של גידולים7. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה על ידי יואן ואחרים דיווח על נוכחות של מולקולות mtDNA hypermutated וקטוע בסרטן הכליות, המעי הגס ובלוטת התריס8. יתר על כן, עבודות רבות הוכיחו כי מוטציות מסוימות mtDNA קשורות לפנוטיפ גידול אגרסיבי יותר ולעלייה בפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים 9,10,11,12,13,14,15,16.
למרות הרלוונטיות לכאורה של הגנום המיטוכונדריאלי בהתקדמות הסרטן, המחקר של מוטציות אלה ותרומתן למחלה היה מאתגר בשל מגבלות במודלים ובטכנולוגיות הניסוי הזמינות כיום17. לכן, יש צורך בטכניקות חדשות כדי להבין את ההשפעה האמיתית של DNA מיטוכונדריה על התפתחות מחלות סרטן והתקדמותן. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף, המבוסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת, המתגבר על האתגרים העיקריים של שיטות גישור מסורתיות18,19. מתודולוגיה זו מאפשרת שימוש בכל תורם גרעינים ללא קשר לזמינות קו תאי ρ0 המתאים להם ולהעברת מיטוכונדריה מתאים אשר, בעקבות הטכניקות המסורתיות, יהיה קשה לחנך (כלומר, קווי תאים שאינם דבקים).
מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים “גליקוליזה אירובית”3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי ש…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי מענק מספר PID2019-105128RB-I00 ל- RSA, JMB ו- AA, ו- PGC2018-095795-B-I00 ל- PFS ו- RML, שניהם מומנו על ידי MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ומספרי מענקים B31_20R (RSA, JMA ו- AA) ו- E35_17R (PFS ו- RML) ומומנו על ידי Gobierno de Aragón. העבודה של RSA נתמכה על ידי מענק של Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. המחברים מבקשים להכיר בשימוש ב-Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
Boric acid | PanReac | 131015 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
EDTA | PanReac | 131026 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
Geneticin | Gibco | 10131027 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
SspI | New England Biolabs | R3132 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris | PanReac | P14030b | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |